小麦是人类栽培的最重要的粮食作物之一，主要用于食用。由于小麦的遗传基因背景复杂，转基因小麦品种的研究比其他作物花费了更长的时间。目前，国外已经有商品化的转基因小麦问世，国内也有转基因小麦品系正在申请商品化生产。下面介绍的方法适用于高分子量谷蛋白亚基转基因小麦品系B73-6-l、B72-8-11b、B102-1-2及其制品中转基因成分普通PCR的筛选检测和实时荧光PCR的确证检测。不适用于以小麦胚油为原料的深加工产品中转基因成分普通PCR和实时荧光PCR定性检测。

一、检测原理

样品经过提取DNA后，针对转基因小麦基因组中含有的内源基因、外源基因所设计的引物和探针序列，分别利用定性PCR和实时荧光PCR技术，特异性扩增对这些基因的DNA片段，并根据PCR和实时荧光PCR实验结果，判断该样品的核酸中是否含有转基因成分。

二、试剂与材料

三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、氯化镁、70％乙醇、2mg／L RNA酶溶液(RNase A)、脱氧核苷三磷酸dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP)、10mg／mL溴化乙锭溶液、DNA相对分子质量标记物(100～2000bp)、琼脂糖、尿嘧啶糖基化酶(UNG酶，UraciI N-gIycosyIase)。

CTAB裂解液：3％CTAB(质量分数)、1.4mmol／L NaCl、0.2％(体积分数)巯基乙醇、20mmol／L EDTA-Na2·2H2O、100mmol／L Tris，pH 8.0。

引物和探针：根据表1l-5和表11-6的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100/μmoI/L储存，用于PCR测试的引物浓度为10μmol／L。

TE缓冲液(pH 8.0)：量取10mL 1 mol／L Tris-HCI溶液(pH 8．0)和2mL 500mm01／L EDTA溶液，加水定容至1000mL，分装后高压灭菌备用。

10×PCR缓冲液：100mmol／L氯化钾，160mmol／L硫酸铵，20mmoI/L硫酸镁，200mmol/L Tris—HCl(pH8.0)，1％Triton X-100，lmg／mL BSA。

50×TAE缓冲液：称取484g Tris，量取114．2mL冰乙酸、200mL 500mmol/L EDTA溶液(pH 8.0)，溶于蒸馏水中，定容至2L，分装后高压灭菌备用。

10×上样缓冲液：含0．25 %溴酚蓝，0．25 %二甲苯青FF，30％甘油水溶液。

2％琼脂糖凝胶：称取2．0g琼脂糖，于100mL 1×TAE缓冲液中-用微波炉加热溶解琼脂糖，冷却至55~60℃，加入10mg／mL溴化乙锭溶液约5μL至终浓度为0.μg／mL左右，轻轻摇匀，缓慢倒在制胶模具上。

三、仪器

定性基因扩增(PCR)仪、核酸电泳仪(水平)、电泳槽、凝胶成像分析系统、紫外可见分光光度计、天平(感量lmg、0.1mg)、高压灭菌锅、超低温冰箱、冷冻离心机、水浴锅、微波炉、微量加样器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)、Eppendorf离心管(1.5mL、2.0mL)、PCR反应管(200μL、500μL)、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、超纯水器、旋涡振荡器、磁力搅拌器。