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样品中DNA的提取——CTAB法

发布时间:2014-10-24 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1669

CTAB提取缓冲液I:配制1L CTAB提取缓冲液王,应在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠,摇动容器使溶质完全溶解,然后加入50mL 1mol/L Tris—HCl(pH 8.0)[在800rnL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0(约需42mL浓盐酸),加水定容至1L,分装后高压灭菌],20mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)[在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用氢氧化钠(NaOH)调节溶液的pH值至8.0(约需20g氢氧化钠颗粒)然后定容至1L,分装后高压灭菌],用水定容至1L,分装后高压灭菌。

检测转基因大豆内源基因和外源基因的引物及其信息,用TE缓冲液(pH 8.0)或重蒸水分别将表1 1—14引物稀释到10μmol/L。

CTAB提取缓冲液Ⅱ:配制1L CTAB提取缓冲液Ⅱ,应在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠、20g溴代十六烷基三甲胺(CTAB),摇动容器使溶质完全溶解,然后加入50mL 1mol/L Tris—HCl(pH 8.0)、20m L 0.5mol/L EDTA(pH 8.0),用水定容至1L,分装后高压灭菌。

乙酸钠溶液:配制lL乙酸钠溶液,应在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2,用水定容至1I.,分装后高压灭菌。

RNase A:将10mg胰RNA酶溶解于987μL水中,然后加入1mol/L Tris -HCl(pH 8.0) 10μL在800rnL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加入60rnL浓盐酸,冷却至室温后调节pH值至7.5,加水定容至1L,分装后高压灭菌],5mol/L氯化钠3μL(在800mL水中溶解292.2g氯化钠,加水定容至1L,分装后高压灭菌),于100℃水浴中保温15min,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于一20℃。

PCR产物回收试剂盒,按使用说明操作。

通常实验室仪器设备、高速冷冻离心机(12000r/min)、高速台式离心机(12000r/min)、紫外分光光度计、磁力搅拌器、高压灭菌锅、PCR扩增仪、电泳仪、紫外透射仪、凝胶成像系统或照相系统、重蒸馏水仪。

将100mg充分粉碎的大豆样品,在液氮中充分研磨成粉末后加400/2L冰上预冷的CTAB提取缓冲液I中。加入500μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液Ⅱ,1μL2一巯基乙醇,混匀,65℃保温30~90min,期问不时轻缓颠倒混匀。待冷却至室温后加入5μL RNase A储备溶液,室温下放置30min。加入450μL三氯甲烷+异戊醇,轻缓颠倒混匀溶液12000r/min离心2min至分相。将上清液转移至于净的离心管中,依次加600μL异丙醇及60μL乙酸钠溶液,轻缓颠倒混匀。12000r/min离心10min。弃上清液,加入800μL76%乙醇,12000r/min离心5min,弃上清液后再加入100#L 70%乙醇洗涤沉淀。12000r/min离心5min,弃上清液。除去残留的乙醇,待沉淀干燥后,DNA沉淀溶解于100pL TE缓冲液中-20℃保存备用。

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