实时荧光PCR定性检测
来源/作者:中国标准物质网  日期:2014-10-25 16:04:44

(1)引物和探针油菜籽及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列。

(2)实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表11—20,反应体系中各试剂的用量,可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。每个反应体系应设置两个平行测试。

(3)实时荧光反应参数 实时荧光定量PCR的反应参数为:37℃,5min;预变性,95℃,3min;95℃,15s,60℃,lmin,40个循环。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。

(4)实时荧光PCR结果分析

①阈值设定实时荧光PCR反应结束后,应设置荧光信号阈值,一般选择3~15个循环的阴性对照的10倍标准差作为阈值。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点,且以Ct值=40为准。

②实时荧光PCR定性检验的质量控制 空白对照:外源基因检测Ct值大于或等于40,内参照基因检测Ct值大于或等于40。阴性对照:外源基因检测Ct值大于或等于40,内参照基因检测Ct值在20~30。阳性对照:外源基因检测Ct值小于或等于34。上述指标有一项不符合者,应重新做实时荧光PCR扩增。

实时荧光PCR结果判定 测试样品外源基因检测Ct值大于或等于40,内参照基因检测Ct值20~30者,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品未检出转基因成分。测试样品外源基因检测Ct值小于或等于36,内参照基因检测Ct值20~30者,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品检出转基因成分。测试样外源基因检测Ct值在36~40,应重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,则可判定为该样品检出转基因成分。再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,则可判定为该样品未检出转基因成分。