5 分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 含蛋白脂肪试样

5.1.1.1 称取粉碎均匀后固体试样1g～2g(精确到0.001g),混匀后液体试样1g～5g(精确到 0.001g)置于50mL离心管中，加入5mL水,涡旋混合器上振荡3min后加入15mL甲醇,继续振荡 30s,超声波提取20min,以3000r/min离心10min,将上清液移入50mL离心管中。沉淀物加入 5.0mL甲醇水溶液(75+25),玻棒搅拌均匀后，涡旋混合器上振荡30s,以3000r/min离心10min,重 复提取2次,将上清液合并于150mL分液漏斗中。

5.1.1.2 在150mL分液漏斗内，加入30mL正己烷,振摇2min,静置分层，20min后，下层水相移置 于50mL蒸发皿。蒸发皿于沸水浴上蒸发，当蒸发皿中液体在1mL左右时用9mL水分三次冲洗蒸 发皿，冲洗液合并移置于15mL离心管中，超声波处理5min,以3000r/min离心10min。

5.1.1.3 取全部上清液移入已活化的固相萃取柱,控制液体流速不超过每秒1滴,柱上液面为2mm左 右时加入1mL水,继续保持液体流速为每秒1滴，到柱中液体完全排出后,用3mL甲醇洗脱,收集甲 醇洗脱液。洗脱液置于50mL蒸发皿内，于沸水浴上蒸干，残渣用1.00mL乙腈水溶液(11+89)溶解 (如溶液有浑浊现象可将其移入离心管，10000r/min离心5min),溶液过0.45um滤膜,滤液为制备的 试样溶液,备用。

注：果冻类样品经提取后的上清液需50℃水浴加热后趁热过柱，否则易堵塞萃取柱。

5.1.2 酱及酱制品、醋、酱油

称取混匀后试样2g(精确到0.001g),置于50mL离心管中，加入1.0g中性氧化铝，加入3mL 水，涡旋混合器上振荡3min后加入15mL甲醇，以下步骤自5.1.1.1“继续振荡30s,超声波提取 20min,以3000r/min离心10min”开始，到5.1.1.3“滤液为制备的试样溶液，备用”为止依次处理。

5.1.3 含酒精的试样(发酵酒、配制酒)

称取混匀后试样5g(精确到0.001g),置于50mL蒸发皿中，于沸水浴上蒸干,残渣用1.00mL乙腈水溶液(11+89)溶解,溶液过0.45um滤膜,滤液为制备的试样溶液,备用。

5.1.4 饮料

称取混匀后试样5g(精确到0.001g),置于15mL离心管中，加入5mL水，涡旋混合器上振荡30s。以3000r/mim离心10mim。以下步骤按5.1.1.3 处理。

5.1.5 风味发酵乳、奶茶

称取混匀后试样1g～5g(精确到0.001g)置于50mL离心管中，加入5mL水，涡旋混合器上振荡3mim后加入15mL甲醇、0.50mL乙酸锌溶液,0.50mL亚铁氰化钾溶液，以下步骤自5.1.1.1“继续振 荡30s,超声波提取20mim,以3000r/mim离心10mim”开始，到5.1.1.3“滤液为制备的试样溶液，备 用。”为止依次处理。

不同试样的前处理需要同时做试样空白试验。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C₁₈柱(4.6mm×150mm,5um)或性能相当者。

5.2.2 流动相：水+乙腈=89+11。

注：当检测样品基质复杂,强保留物质影响后续检测时,可采取洗脱程序(蒸发光散射检测器适用)。

5.2.3 流速：1.0mL/mim。

5.2.4 柱温：35℃。

5.2.5 示差检测器条件：

—检测池温度：35℃；

—灵敏度:16。

5.2.6 蒸发光散射检测器条件:按不同品牌蒸发光散射检测器在高水相流动相条件下的要求设置。

如SEDEX75:

雾化压力：3.5Ear；增益：8；蒸发温度：40℃。或性能相当者。

5.2.7 进样量：20.0uL。

5.3 标准曲线的制作

5.3.1 示差检测器

取三氯蔗糖标准工作液分别进样20.0uL,在上述色谱条件下测定峰面积,然后作峰面积-三氯蔗糖浓度(mg/mL)标准曲线，曲线方程依示差检测原理,见式(1)：

y=ax+b.....(1)

式中：

y—峰面积；

a、b—与检测池温度、流动相性质等实验条件有关的常数；

x—三氯蔗糖的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)。

5.3.2 蒸发光散射检测器

取三氯蔗糖标准工作液分别进样20.0mL,在给定的色谱条件下测定峰面积,然后作峰面积-三氯蔗糖浓度(mg/mL)标准曲线，曲线方程依蒸发光散射检测原理,见式(2)：

y=bxa.......(2)

式中：

y—峰面积；

a、b—与蒸发室温度、流动相性质等实验条件有关的常数；

x—三氯蔗糖的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)。

按仪器数据处理软件的处理方式不同，也可作对数方程，即1gy=b+algx。

5.4 试样溶液的测定

取制备的试样溶液和空白试样溶液各20.0uL进样,进行高效液相色谱分析。以保留时间定性，以峰面积外标法定量。

6 分析结果的表述

试样中三氯蔗糖含量按式(3)计算：

式中：

X—试样中三氯蔗糖的含量,单位为克每千克(g/kg);

C—由标准曲线查得试样进样液中三氯蔗糖的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；

C₀—由标准曲线查得空白试样进样液中三氯蔗糖的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V—试样定容体积,单位为毫升(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)；

1000——换算系数。

结果保留三位有效数字。

7 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

8 其他

当取样量2.00g,定容至1.00mL时，检出限均为0.0025g/kg,定量限均为0.0075g/kg。

相关链接：食品中三氯蔗糖(蔗糖素)的测定（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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