黄曲霉毒素(aflatoxin)是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，是目前为止最强的致癌物质。黄曲霉毒素由一组大约17种相关的真菌代谢产物组成，在植物来源的食物中通常只污染黄曲霉毒素B，B，G和G，其中产生黄曲霉毒素B的量比其他黄曲霉毒素多，而且B的毒性最强，急性中毒的毒性是氰化钾的10倍，慢性毒性可诱发肝癌。黄曲霉毒素可通过多种途径污染食品和饲料，直接和间接进入人类食物链，从而威胁人类健康和生命安全，对人体及动物器官尤其是肝脏损害严重，其诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍。中药在采集、贮藏、制备、运输过程中如保存不当极易受潮霉变而污染黄曲霉毒素。对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证药用安全具有重要意义。

为进一步加强中药材的质量控制，进一步增加中药的安全性指标控制项目，尤其是加强对中药材中重金属及有害元素、黄曲霉毒素、农药残留量的控制，2012年10月25日，国家药典委员会在2010年版《中国药典》的基础上，发布了有关中药重金属、农药残留、黄曲霉毒素等物质的限量标准草案。拟对《中国药典》收载的柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为“黄曲霉毒素B1不得过5ug/kg；黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2，总量不得过10ug/kg”。

一、光化学衍生法

2010年版药典第二增补本修订该法，增加光化学衍生法。本法系用高效液相色谱法(通则0512-Ⅵ D)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计)。

(一) 原理

本方法基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离—柱后光化学衍生或碘衍生—荧光检测器检测进行分析测定。碘衍生法需采用专门的柱后衍生装置，光化学衍生法则需配备柱后光化学衍生器。但光化学衍生法由于不需任何衍生试剂，因此测定基线更为稳定，同时由于可方便开关光化学衍生器，因此便于排除部分假阳性反应。碘衍生反应如下：

光学化衍生反应如下：

(二) 仪器与用具

高速匀浆器、振荡器；高效液相色谱单元，配荧光检测器(具360nm激发波长和大于420nm发射波长)；光化学衍生器或柱后衍生系统；离心机；超纯水处理系统；超声波提取器；黄曲霉总量(B₁、B₂、G₁、G₂)免疫亲和柱；固相萃取装置；离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。

(三) 试药与试液

甲醇、乙腈均为色谱纯；高纯水；黄曲霉毒素混合对照品；0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml即得。

(四) 色谱条件与系统适应性试验

1. 光化学衍生法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：40℃；以甲醇-乙腈-水(40：18：42)为流动相，按表13-3中的梯度比例进行梯度洗脱，流速1.1ml/min；采用柱后光化学衍生法：光化学衍生器(254nm)；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm，发射波长λem=450nm。进样量：20～50ul(视灵敏度进行调整)。

表13-3 HPLC梯度洗脱程序

2. 碘衍生法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)为流动相，流速0.8ml/min；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液，衍生化泵流速0.3ml/min，衍生化温度70℃。以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm，发射波长λem=450nm。进样量：20～50ul(视灵敏度进行调整)。

按上述条件操作，理论板数以B计应不低于5000，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

(五) 操作方法

1. 混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品(黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml)0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得：

2. 供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速匀浆2分钟(搅拌速度大于11000转/min)，离心5分钟(离心速度2500转/分钟)，精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，调节pH为6.8～7.2，用水(或PBS缓冲液)稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，精密量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱，流速每分钟3ml，用水20ml分两次洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子。将水挤出柱子。再用适量甲醇分次洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3. 测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积(图13-11、13-12)，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～50ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，计算，即得。

图13-11 当归样品及低、中、高浓度回收色谱图

图13-12 混合对照品及薏苡仁供试品色谱图

(六) 注意事项

1. 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

2. 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器(装有10%次氯酸钠溶液)内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿清洗干净。实验废液也需加入次氯酸钠进行处理。

3. 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性，所以混合黄曲霉毒素对照品储备液应配制在棕色容量瓶中并避光保存。混合黄曲霉毒素对照品溶液则需临用新配，并注意避光。

4. 当供试品溶液进样量超过20ul时，为保证获得良好色谱普峰峰形，供试液制备中最后可用水稀释至刻度。

5. 随行回收率：加标浓度<1.0ug/kg，回收率应控制在60%～120%；加标浓度1～10ug/kg，回收率应控制在70%～110%。

6. 方法检出限以黄曲霉毒素B1计应不得高于0.5ug/kg。

相关链接：中药材中二氧化硫残留量测定法（三）

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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