北京普天同创生物科技有限公司
本标准按照GB/T 1.1-2020给出的规则编写。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中国石油和化学工业联合会提出。
本标准由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC105)归口。
本标准起草单位:上海海关工业品与原材料检测技术中心、上海市农业科学院、上海化工院检测有 限公司、上海交通大学农业与生物学院。
1 范围
本标准规定了有机肥中19种兽药残留量的液相色谱串联质谱测定方法。
本标准适用于以家禽粪肥为主要原料的商品有机肥中金刚烷胺(AMT)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺哒嗪(SDZ)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲基嘧啶(SMI)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SM)、磺胺甲氧哒嗪(SMPZ)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDO)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)、诺氟沙星(NFC)、环丙沙星(CFC)、恩诺沙星(EFC)、氧氟沙星(OFC)残留量的测定。
检测限:STZ,SMM,SMT,SCP 均为5µg/Kg;其余均为20µg/Kg。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。
3 原理
试样中残留的兽药,用 McIlvain-EDTA溶液及乙腈/乙酸(9/1, v/v)溶液提取,经HLB固相萃取柱净化,用高效液相色谱串联质谱仪进行测定,外标或内标法定量。
4 试剂与材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为符合残留检测要求的试剂和符合 GB/T 6682 一级的水。除非另有说明,所有试剂均为分析纯。
4.1 金刚烷胺、磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氘代诺氟沙星(诺氟沙星-D5)、氘代环丙沙星(环丙沙星-D8)、氘代恩诺沙星(恩诺沙星-D5),纯度不小于 95%。
4.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。
4.3 乙腈(CH3CN):色谱纯。
4.4 甲酸(HCOOH):色谱纯。
4.5 柠檬酸(C5H8O7·H2O)。
4.6 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。
4.7 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)。
4.8 乙酸(CH3COOH)。
4.9 0.1 mol/L柠檬酸溶液:称取21.01 g柠檬酸(4.5),用水溶解,并定容至1 000 mL。
4.10磷酸氢二钠溶液: 0.2 mol/L。称取71.63 g磷酸氢二钠(4.6),用水溶解,并定容至1 000 mL。
4.11 Mcllvaine缓冲溶液:将1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液(4.9)与625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液(4.10)混合,必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0 ± 0.05。
4.12 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.02 mol/L。称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠(4.7)放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液(4.11)中,使其溶解,然后用纯水5倍稀释,混匀。
4.13 乙腈+乙酸(9+1):量取10 mL乙酸(4.8)与90 mL乙腈(4.3)混合。
4.14 0.1%甲酸水:准确吸取1 mL甲酸(4.4)于1 000 mL容量瓶中,用纯水稀释并定容至1 000 mL。
4.15 HLB固相萃取小柱:Waters Oasis PRiME HLB 60 mg,3 mL固相萃取柱。
4.16 混合标准储备液(100 μg/mL)
分别称取19种适量的兽药标准物质(4.1),用甲醇溶解配制成100 μg/mL的标准储备液,-18 ℃冰箱中保存,有效期3个月。
4.17 混合标准工作液(1μg/mL)
准确吸取混合标准储备液适量(4.16),用甲醇稀释配成 1μg/mL混合标准工作液,4 ℃下保存,有效期1周。
4.18 氘代同位素内标储备液(100 μg/mL)
分别称取适量的氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星标准物质,用甲醇溶解配制成100 μg/mL的标准储备液,-18 ℃冰箱中保存,有效期3个月。
4.19 混合内标工作液(5μg/mL和 1 μg/mL)
准确吸取适量氘代同位素内标储备液(4.18),用甲醇稀释配成 5μg/mL和 1 μg/mL的内标工作液,4 ℃ 下保存,有效期1周。
4.20 复溶液配置:准确吸取6.6 mL的磷酸以及7.4 mL的三乙胺与1 000 mL的水混合,取85mL混合后的溶液与15 mL乙腈混合
5 仪器和设备
5.1 高效液相色谱串联质谱仪。
5.2 天平:感量 0.1 mg,0.00001 g。
5.3 离心机:转速不低于 4 000 r/min。
5.4 震荡器。
5.5 滤膜:0.22μm。(亲水 PTFE 滤膜或相当者)
5.6 pH 计:测量精度 0.02。
6 试样制备
按照 GB/T 8571 规定制备实验室样品。试样制备时样品研磨过 1 mm 试验筛,若样品很难研碎,可研磨至通过 2 mm 试验筛。试样置于-18℃避光保存。
7 分析步骤
7.1 提取
称取(2.0 ± 0.02) g 试样于 50 mL 离心管中,加入 100 μL 的 5μg/mL 内标工作液(4.19)混匀,再加入 5 mL Na2EDTA-Mcllvaline 缓冲液 (4.12),混匀后再加入 20 mL 乙腈+乙酸(4.13),在振荡器上振摇 20 min,4 000 r/min 离心 10 min,上清液备用。
7.2 净化
取 Waters Oasis PRiME HLB 60 mg,3 mL 固相萃取柱,将 2 mL 上清液过固相萃取柱,保持约一秒一滴的流速,准确量取 1 mL 流出液过 0.22 μm 滤膜,待上机测试。
7.3 基质匹配标准曲线的制备
7.3.1 外标基质匹配标准溶液制备
取空白有机肥料试样,按 7.1 和 7.2 步骤处理,在洗脱液中加入混合标准工作液(4.17),配置浓度为0.010、0.020、0.050、0.100、0.150 及 0.200 μg/mL 的系列标准曲线工作溶液,用液相色谱-串联质谱仪测定(条件参考表 1,表 2)。以定量离子的峰面积为纵坐标,标准溶液质量浓度为横坐标,绘制基质匹配标准曲线。
7.3.2 内标基质匹配标准曲线制备
取空白有机肥料试样,按 7.1 和 7.2 步骤处理,在洗脱液中加入混合标准工作液(4.17)和混合内标工作液(4.19),配成浓度为 0.010、0.020、0.050、0.100、0.150 及 0.200 μg/mL 的系列基质匹配标准溶液(内标浓度为 0.010 μg/mL),用液相色谱-串联质谱仪测定。氧氟沙星和诺氟沙星用氘代诺氟沙星为内标;环丙沙星用氘代环丙沙星为内标;恩诺沙星用氘代恩诺沙星为内标。以诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的定量离子的峰面积和相对应内标物的定量离子峰面积的比值为纵坐标,标准溶液质量浓度为横坐标,绘制内标基质匹配标准曲线。
7.4 测定
7.4.1 色谱参考条件
a) 色谱柱:C18柱,Thermo Hypersil GOLD aQ,100 mm × 2.1 mm(i.d.),1.9 μm,或相当规格色谱柱;
b) 色谱柱温度:30 ℃; c) 流动相:A 相为甲醇;B 相为 0.1%甲酸水溶液(4.14);
d) 流速:0.4 mL/min; e) 梯度洗脱:梯度洗脱条件见表 1。 f) 进样体积:2 μL;
7.4.2 质谱参考条件
a) 离子源:电喷雾离子源(ESI);
b) 扫描方式:正离子扫描;
c) 检测方式:选择反应监测;
d) 喷雾电压:3800 V;
e) 离子传输管温度:350 ℃;
f) 氮气作为鞘气和辅助气,鞘气压力为40 arb, 辅助气压力为10 arb;
g) 氩气作为碰撞气, 碰撞压力为1.5 mTorr;
h) 测试物质母离子、定量/定性离子及相应碰撞能量和锥孔电压见表2。
7.5 定性定量方法
7.5.1 定性方法
在相同实验条件下,样品中待测物的保留时间与基质匹配标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之 内,且样品中待测物的目标化合物的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的对应离子相对丰度偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。
7.5.2 定量方法
1. 取试样溶液和基质匹配标准溶液,作多点校准,外标法和内标法计算。诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星(共四种)采用内标法定量;其余(15 种)金刚烷胺、磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶用外标法定量。试样溶液和基质匹配标准溶液中各兽药的响应值均应在仪器检测的线性范围之内,超出范围需稀释进样测定,低于范围需按7.1 和 7.2 步骤提取净化后,准确量取 2.5 mL 流出液,40℃水浴氮气吹干后用 1 mL 复溶液(4.20)溶解,过 0.22µm 滤膜,待上机测试。
7.6 空白试验
除不加试样外,按上述(7.1~7.4)步骤进行。
8 结果计算
试样中各兽药残留量以质量分数 ω 计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,内标法按公式(1)计算,外标法按公式(2)计算。
式中:
ω 内标———用内标法测得的试样中被测物残留量,单位为毫克每千克(mg/kg);
ω 外标———用外标法测得的试样中被测物残留量,单位为毫克每千克(mg/kg)
Ci ——— 样品制备液中喹诺酮类药物残留的浓度,单位为毫克每升(mg/L)
ρ———基质标准工作溶液中被测物的质量浓度,单位为微克每毫升(µg/mL);
A——试样溶液中被测物的色谱峰面积;
As——基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积;
V——试样溶液最终定容体积,单位为毫升(mL);
m——试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g)。
注:计算结果应扣除空白值,计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留两位有效数字。
8 精密度
在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限(r),参见附录D。
在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限(R),参见附录D。
附 录 A (资料性附录)
标准溶液和空白样品添加回收的总离子流图
A.1 19 种兽药及 3 种内标混合标准溶液总离子流图
见图 A.1
A.2 19 种兽药及三种内标混合标准溶液选择离子流图
见图 A.2
A.3 空白有机肥样品种添加回收的选择离子流图
见图A.3
附录 B 氮吹浓缩操作
B.1 复溶液配置:准确吸取6.6 mL的磷酸以及7.4 mL的三乙胺与1 000 mL的水混合,取85mL混合后的溶液与15 mL乙腈混合。
B.2 氮吹浓缩操作:按 7.1 和 7.2 步骤提取净化后,准确量取 2.5 mL 流出液,40℃水浴氮气吹干后用 1 mL 复溶液溶解,过 0.22µm 滤膜,待上机测试。
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