乌梢蛇PCR分子鉴定

本品为游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades (Cantor)的干燥体。

【鉴别】聚合酶链式反应法。

1. 模板DNA提取 取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨成粉末(采用机械力低温破碎植物细胞)，取0.1g，置1.5ml离心管中，加入消化液275ul[细胞液裂解液200ul]，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液50ul，蛋白酶K(20mg/ml)20ul，RNA酶溶液5ul]，在55℃水浴保温1小时，加裂解缓冲液250ul(将DNA溶解出)，混匀，加到DNA纯化柱中，离心(转速为每分钟10000转)3分钟，弃去过滤液，加入洗脱液800ul[5mol/L醋酸钾溶液26ul，1mol/L Tris-盐酸溶液(pH7.5)18ul，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液(pH8.0)3ul、无水乙醇480ul，灭菌双蒸水273ul]，离心(转速为每分钟10000转)1分钟，弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心(转速为每分钟10000转)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转人另一离心管中，加人无菌双蒸水100ul，室温放置2分钟后，离心(转速为每分钟10000转)2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取乌梢蛇对照药材0.2g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

2. PCR反应 鉴别引物：5'GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3'和5'CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3'。PCR反应体系：在200ul离心管中进行，反应总体积为25ul，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5ul，dNTP(2.5mo/L)2ul，鉴别引物(10umol/L)各0.5ul，高保真TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.2ul，模板0.5ul，无菌双蒸水18.8ul。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反复30次(95℃30秒，63℃45秒)，延伸(72℃)5分钟。

3. 电泳检测照2015年版《中国药典》四部琼脂糖凝胶电泳法(通则0541)，胶浓度为1%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材PCR反应溶液上的上样量分别为8ul，DNA分子量标记上样量为2ul(0.5ug/ul)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300～400bp应有单一DNA条带。

蕲蛇PCR分子鉴定

本品为蛙科动物五步蛇Agkistrodon acutus(Guenther)的干燥体。

【鉴别】聚合酶链式反应法。

1. 模板DNA提取取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研成至粉末(采用机械力低温破碎植物细胞)，取0.1g，置1.5ml离心管中，加入消化液275ul[细胞液裂解液200ul]，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液50ul，蛋白酶K(20mg/ml)20ul，RNA酶溶液5ul]，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250ul(将DNA溶解出)，混匀，加到DNA纯化柱中，离心(转速为每分钟10000转)3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液800ul[5mol/L醋酸钾溶液26ul，1mol/L Tris-盐酸溶液(pH7.5)18ul，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液(pH8.0)3ul、无水乙醇480ul，灭菌双蒸水273ul]，离心(转速为每分钟10000转)1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心(转速为每分钟10000转)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转入另一离心管中，加入无菌双蒸水100ul，室温放置2分钟后，离心(转速为每分钟10000转)2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取蕲蛇对照药材0.2g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

图18-33 乌梢蛇DNA凝胶电泳图谱

2. PCR反应 鉴别引物：5'GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3'和5'CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3'。PCR反应体系：在200ul离心管中进行，反应总体积为25ul，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5ul，dNTP(2.5mol/L)2ul，鉴别引物(10umol/L)各0.5ul，高保真TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.2ul，模板0.5ul，无菌双蒸水18.8ul。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反复30次(95℃30秒，63℃45秒)，延伸(72℃)5分钟。

3. 电泳检测 照2015年版《中国药典》四部琼脂糖凝胶电泳法(通则0541)，胶浓度为1%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材PCR反应溶液上的上样量分别为8ul，DNA分子量标记上样量为2ul(0.5ug/ul)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在200～300bp应有单一DNA条带。

图18-34 蕲蛇DNA凝胶电泳图谱

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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