基于PCR技术快速检测食品微生物的原理与方法应用

由食源性微生物导致的农产品和食品安全问题越来越引发人们的关注。传统的微生物检测方法费时、操作复杂。因此，针对食品中的致病和致腐微生物的快速检测方法已成为国内外学者的研究热点。食品微生物的快速检测方法的建立和推广，对于防止食源性微生物危害，开展主动监测与预警具有重要意义。

聚合酶链反应(PCR) 方法应用于微生物检验， 具有快速、特异性强、灵敏度高等突出优点，因此越来越得到学术界的重视。

(一) PCR扩增原理

PCR(Polymerase ChainReaction) ， 即聚合酶链反应， 是由Kary Mullis等人首创的一项体外快速扩增DNA的方法， 它可使极微量的某一特定序列的DNA片段在数小时内特异性扩增至百万倍以上。PCR扩增DNA通常由20~40个PCR循环组成。每个循环由高温变性、低温退火、适温延伸3个步骤组成。高温时， DNA变性，氢键打开，双链变为单链以作为扩增的模板；低温时，一对引物(即左端引物和右端引物) 分别与模板DNA的2条单链特异性互补结合， 即退火； 然后适温时， 在DNA聚合酶介导下， 将4种三磷酸脱氧核苷(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 按碱基互补配对原则不断添加到引物末端， 按5'→3'方向将引物延伸自动合成新的DNA链， 使DNA重新变成双链。将合成的DNA双链不断重复以上的变性、退火、延伸过程， 则左、右引物间这段DNA的量就可指数倍增加。若重复进行这一反应n次， 从理论上讲原始的DNA数量可以被扩增为原来的2”倍， 因此DNA的量在短时间内特异性地获得了极度的放大。

(二) PCR反应体系

PCR反应是将模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、镁离子、缓冲液、双蒸水等混合物装在PCR微型管中， 在可编程调控的PCR仪上完成。

模板DNA：PCR模板可以是单链或双链DNA， RNA分子经反转录成cDNA后同样可作为模板。PCR反应所需起始模板量很低， 甚至可以是单个分子。用作PCR模板的DNA样本通常也不需要很纯。

引物(Primer) ：与待扩增DNA片段两侧互补的单链寡聚核苷酸片段， 通常长15~25个碱基。引物是决定PCR扩增特异性的关键因素， 它决定了PCR扩增的区域和扩增产物的长度。PCR反应通常包括2个引物：左端引物是扩增片段编码链的上游一段DNA； 右端引物是非编码链下游的一段DNA。引物设计的好坏直接决定了PCR扩增的成败。设计引物通常遵循如下原则：

①引物GC含量以45%~55%为佳，GC应随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象；

②引物内部不宜形成发夹结构；

③2种引物T，值应尽可能接近；

④2个引物之间，尤其是3'末端附近不能互补。

DNA聚合酶：PCR反应中的常使用耐高温DNA聚合酶Taq酶。Tag酶缺乏校对功能，扩增片段出错率较高，大约每5000个碱基就有1个错配，不过对绝大多数扩增不造成什么问题。目前具校对功能的高保真DNA聚合酶已广泛使用， 使得PCR技术的应用更加广泛。

dNTPs：为PCR扩增的“原料”， 由相同浓度的4种脱氧核苷(dATP、dGTP、dTTP、dCTP) 组成。

Mg²+：是Taq酶活力所必需的金属离子。通常使用浓度为1~2.5mmol/L。缓冲液(Buffer) ：常用10~50mmol/L的Tris-HCl(pH为8.3~8.8) 体系。

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文章来源：《食品快速检测实训教程》

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