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固相萃取方法的优化

发布时间:2014-11-14 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:985

洗脱条件的选择将直接影响目标化合物的回收率。洗脱条件包括洗脱溶剂的性质、体积、流速、pH等,其中溶剂的性质和pH最为重要。

验证所选择的洗脱溶剂是否合适,最直接的方法是用该溶剂(与洗脱时的体积、pH相同)溶解目标化合物。然后按照初步建立的SPE方法操作:柱子预处理、样品添加(加入空白水)、柱子洗涤、干燥。在进行洗脱时将添加了目标化合物的洗脱溶剂按照原定的流速通过SPE柱,并测定回收率。如果回收率偏低,说明洗脱条件不合适。这时,要检查洗脱过程的pH是否符合设定的萃取机理。如果pH不合适,就可能无法按照设计的萃取模式进行洗脱,出现回收率偏低的结果。在用离子交换柱进行固相萃取时,要特别注意洗脱时的pH是否满足将99%以上被离子交换剂吸附的目标化合物释放出来的条件。其次,就是要检查所使用的洗脱溶剂的洗脱强度是否足够将目标化合物从柱子中洗脱出来,为了方便起见,我们将初步方法中的洗脱溶剂称为洗脱溶剂1。在实际操作中,可以在洗脱溶剂1淋洗之后,再用强度比洗脱溶剂l强的溶剂(称为洗脱溶剂2)对萃取柱进行淋洗,并单独收集这一组分进行检测。如果在洗脱溶剂2的组分中检测到目标化合物,就说明洗脱溶剂1强度不够,需要更换洗脱强度更强的溶剂。如果回收率依然偏低,就要考虑萃取柱的吸附力是否过强。可以改用吸附力相对较弱的萃取柱重新进行整个萃取程序操作。

在排除了洗脱溶剂因素后,回收率依然偏低,就要回过头来考虑目标化合物在SPE柱的洗涤过程中是否有损失。洗涤溶剂选择的不恰当也会导致目标化合物损失。当用含有5%甲醇的水溶液对C18萃取柱进行洗涤时,相对保留较弱的化合物如1,7一二甲基黄嘌呤和茶碱的回收率与纯水作为洗涤剂比较有明显的降低。

验证目标化合物是否在洗涤过程中受到损失的方法有三种。一种方法是按原设计的萃取方法重新再做一次萃取,但略去洗涤步骤,直接进入洗脱步骤。如果回收率明显提高了,就说明洗涤溶剂不合适。但如果干扰物对目标化合物的检测有影响,例如,干扰物与目标化合物的色谱峰部分或全部重叠,这种方法就不宜使用。另一种方法是在洗涤过程中收集过柱的洗涤溶液,用适当的方法对所收集的洗涤溶液进行萃取,并检测是否含有目标化合物。如果得到的结果是阳性的,说明洗涤溶剂的洗脱强度过强或SPE柱的吸附力过弱。第三种方法是采用双SPE柱串联的方法。将两根相同的SPE柱上下串联在一起,按照原来的方法进行SPE柱预处理、样品添加、柱洗涤及干燥。在洗脱前将上下两根SPE柱分离,分别进行洗脱。如果在下面SPE柱的洗脱馏分中发现目标化合物,就说明洗涤溶剂强度过大,部分目标化合物在洗涤过程中未能保留在SPE柱上。一旦确定回收率的损失是由洗涤过程产生的,就要对洗涤溶剂进行调整,降低其洗脱强度,也可以改用保留能力更大的SPE柱。

如果测试结果表明回收率达到预期的要求,就可以进入第二步的测试。在第二步的测试中,是将已知浓度的目标化合物添加到空白的样品基质中,充分地搅匀,并放置一段时间,使其尽量接近真实样品的状态。然后再重复上述萃取实验。如果回收率达到预期的要求,就完成了初步的固相萃取方法建立。如果在第一步的测试得到满意的回收率,而在进行第二步测试时回收率有明显地降低,就应该重点考虑固相萃取前的样品处理方法是否妥当,目标化合物是否呈游离状态等因素。对于生物样品,如果目标化合物与样品中的蛋白质结合在一起就无法被SPE柱吸附。有关固相萃取前的样品处理将在第6章中进行详细讨论。对于以离子交换为机理的固相萃取,还应该考虑样品基质的离子浓度。如果离子浓度,特别是与目标化合物带相同电荷的干扰离子浓度过高,势必会影响离子型目标化合物在离子交换柱上的保留。最简单的解决方法就是用去离子水或缓冲溶液对样品进行稀释。

另外,需要考虑的问题还包括柱容量是否足够吸附样品中的目标化合物以及能按相同机理被SPE柱吸附的其他组分(杂质/干扰物)。如果目标化合物和样品基质中可能被保留的其他组分的总量超过了柱容量,必然有一部分目标化合物在样品添加过程中没有被萃取柱保留,使回收率降低。这个问题可以通过增加萃取柱的容量得以解决,也可以在萃取之前采用其他方法尽可能多地除去样品中的杂质。在达到预期回收率的前提下,尽可能将样品中的杂质除去是方法优化中的另外一个主要任务。

在方法优化过程中,为了减少重复实验,最好能够分别收集每一个通过SPE柱的组分,以便在发现萃取结果不理想时,及时对每个组分进行分析并查找原因。

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