12.2.1.1 适用范围

适用于蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。方法检出限：土霉素、四环素为0.001mg/kg；金霉素、强力霉素为0.002mg/kg。

12.2.1.2 方法原理

蜂蜜试样中四环素族抗生素残留，用0.1mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)缓冲溶液提取提取液经离心后，上清液用OasisHLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

12.2.1.3 试剂和材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯：色谱纯；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O)：优级纯；柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)、草酸：分析纯。

磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。

Mellvaine缓冲溶液：将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合，必要时用NaOH或HCI调pH=4.0±0.05。

Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

甲醇+水(1+19，v/v)：量取5mL甲醇与95mL水混合。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质：纯度≥95%。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准贮备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质，分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在-18℃冰柜中。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素基质混合标准工作溶液：根据需要吸取适量土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准贮备溶液，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4℃保存，可使用3天。

OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。

阴离子交换柱：羧酸型，500mg，3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。

12.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；液体混匀器；固相萃取真空装置；贮液器：50mL；微量注射器：25μL，100μL；刻度样品管：5mL，精度为0.1mL；真空泵：真空度应达到80kPa；离心管：50mL；平底烧瓶：100mL；pH计：测量精度±0.02。

12.2.1.5 样品前处理

(1) 试样制备

对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。将试样于常温下保存。

(2) 提取

称取6g试样(精确到0.01g)置于150mL三角瓶中，加入30mLNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解。样液倒入50mL离心管中，以3000r/min离心5min，待净化。

(3)净化

将上清液移至下接OasisHLB柱的贮液器中，以≤3mL/min通过Oasis固相萃取柱后，用5mL甲醇-水洗柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干20min，最后用15mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。

按上述方法使洗脱液在减压情况”下以≤3mL/min的流速通过阴离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇洗柱，弃去全部流出液。在65kPa负压下，减压抽干5min，再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱-串联质谱仪测定。

相关链接：四环素类药物残留分析技术——测定传感器技术

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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