12.2.2.1 适用范围

蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。方法检出限：土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为0.010mg/kg。

12.2.2.2 方法原理

蜂蜜试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)缓冲溶液提取，经离心后，上清液用OasisHLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化，紫外检测器高效液相色谱仪测定，外标法定量。

12.2.2.3 试剂和材料

甲醇、乙腈：一级色谱纯；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O)：优级纯；乙酸乙酯：分析纯，重蒸馏；柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)、草酸：分析纯。

磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL；柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL；Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合，必要时用NaOH或HCl调pH=4.0±0.05；4.11 Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀；甲醇+水(1+19，v/v)：量取5mL甲醇与95mL水混合。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质：纯度≥95%。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质，分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在-18℃。根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液在4℃保存，可使用3天。

OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。

阴离子交换柱：羧酸型，500mg，3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。

12.2.2.4 仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器；分析天平：感量0.1mg，0.01g；液体混匀器；固相萃取真空装置；贮液器：50mL；微量注射器：25μL，100μL；刻度样品管：5mL，精度为0.1mL；真空泵：真空度应达到80kPa；离心管：50mL；平底烧瓶：100mL；pH计：测量精度±0.02。

12.2.2.5 样品前处理

(1) 试样制备

对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并标明标记。将试样于常温下保存。

(2) 提取

称取6g试样，精确到0.01g。置于150mL三角瓶中，加入30mL Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解。样液倒入50mL离心管中，以3000r/min离心5min，待净化。

(3) 净化

将上清液倒入下接OasisHLB柱或相当者的贮液器中，上清液以≤3mL/min的流速通过Oasis或相当的固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5mL甲醇-水洗柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干20min，最后用15mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。

按上述方法使洗脱液在减压情况下以≤3mL/min的流速通过阴离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇洗柱，弃去全部流出液。在65kPa负压下，减压抽干5min，再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱仪测定。

12.2.2.6 测定

(1)液相色谱条件

色谱柱：μBondapakC₁₈，10μ，300mm×3.9mm或相当者；流动相：乙腈+甲醇+0.01mol/L草酸溶液(20+10+70，v/v/v)；流速：1.5mL/min；柱温：25℃；检测波长：350nm；进样量：100μL。

(2)液相色谱测定

根据样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量的情况，选定峰高相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积参差进行测定。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素色谱峰的分离度应大于1.2，其参考保留时间分别是4.0min、4.8min、9.6min、14.0min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质色谱图见图12-4。

图12-4 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质色谱图.
4.027min，土霉素：4.757min，四环素；9.578min，金微素：14.015min，强力霉素

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。