(2)净化方法

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP净化是利用待测物与杂质在互不相溶的两相溶剂中溶解度和分配系数的差异进行的净化。待测物和杂质之间如果有较大极性差异或随着溶液系统pH的变化极性有明显改变时，常选用LLP。LLP遵循相似相溶原则，选择好两相溶剂，充分利用水相pH的调节作用使待测物成游离离子态或结合成中性有机分子，以提高提取效率。本类药物的碱性性质常用作LLP净化的基础。在中性和碱性条件下，硝基咪唑类药物呈分子状态，易于由水相转入有机相，清除水溶性杂质；而在酸性条件下，药物呈离子状态，易于由有机相转入水相，清除脂溶性杂质。因此，硝基咪唑类药物LLP净化中常通过调节溶剂酸碱性转移药物和清除杂质。液液分配虽然操作方便，但也存在缺点，即需要大量有机溶剂进行多次萃取，而且易乳化，影响回收率，特异性较差。

Shen等用乙酸乙酯提取猪组织中MNZ、DMZ、DMZOH和RNZ，提取液吹干后用稀盐酸-正己烷LLP去除脂溶性物质，HPLC测定。LOD为1.0～2.0μg/kg；肌肉中的平均回收率为80.1%～83.9%，肝脏组织为78.9%～82.3%。高小龙测定鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)中MNZ和DMZ残留，用二氯甲烷提取，吹干后，用水-正已烷LLP脱脂，HPLC测定。DMZ及DMZOH的LOQ均为1μg/kg；肌肉中的平均回收率在56.9%～76.5%之间，肝脏在63.3%～72.6%之间，肾脏在64.2%～73.3%之间，脂肪在63.5%～75.7%；日内CV均小于16%，日间CV均小于18%。Sorensen等用乙腈和正己烷提取鱼肉中的MNZ和MNZOH，用正已烷脱脂，将残留物转移至乙腈相，HPLC测定。鱼肌肉中2种药物的LOD均为2.8μg/kg，鱼皮中MNZ的LOD为3μg/kg，MNZOH为5μg/kg；MNZ绝对回收率为93%～81%，MNZOH为79%；CV分别为3.3%和3.2%。黎翠玉等测定猪肉、鸡肉和鱼肉中MNZ、DMZ和RNZ三种硝基咪唑类化合物及两种代谢物MNZOH、HMMNI残留。乙酸乙酯提取液蒸干后，用甲醇和正己烷LLP除脂，LC-MS/MS测定。回收率在61.1%～108.0%之间，RSD为1.9%～6.3%，LOQ为0.1μg/kg。Gaugain等用二氯甲烷提取猪、禽组织中3种硝基咪唑类药物，提取液蒸干，用乙酸铵缓冲液-正己烷LLP脱脂，再用SPE净化，高效薄层色谱(HPTLC)测定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分别为2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。GB/T21318-2007测定动物组织样品中RNZ、IPZ、MNZ、DMZ、ORZ、4-硝基咪唑、CMNI、苯硝咪唑等8种硝基咪唑和2种代谢物MNZOH、HMMNI残留。用饱和氯化钠-甲醇-丙酮提取后，蒸干有机相，加入乙酸乙酯与氯化钠溶液LLP净化，LC-MS/MS测定。LOD为0.5～1μg/kg，回收率为71.4%～115%。

Cronly等测定禽蛋中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ和羟基化代谢物MNZOH、HMMNI、IPZOH。禽蛋用乙腈提取，提取液用氯化钠沉淀杂质，用正已烷与乙腈LLP脱脂，LC-MS/MS测定。CCa为0.33～1.26μg/kg，CCβ为0.56～2.15μg/kg，回收率为87.2%～106.2%。

高小龙测定蜂蜜和蜂王浆中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ残留。蜂王浆用盐酸溶解，氯化钠沉淀杂质，正已烷去脂；蜂蜜样品仅用盐酸溶解稀释，取上层酸液加磷酸氢二钾15g，用二氯甲烷萃取，盐酸反萃取，过SCX SPE柱，用0.5mol/L的磷酸氢二钾溶液(pH8.8)洗脱，洗脱液再萃取至二氣甲烷，HPLC检测。通过调节酸碱性，在水相和有机相多次转移，达到净化效果，缺点是较为繁琐。蜂蜜和蜂王浆中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均为1.0μg/kg；平均回收率分别为59.2%～7.06%和54.9%～69.1%；CV小于18%和16%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品基质和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的，其原理与液相色谱类似。与LLP相比，SPE具有使用有机溶剂较少，速度快，可实现自动化，不会发生乳化，净化后残留的杂质相对较少等优点。硝基咪唑类药物属于中等极性，属于碱性化合物，提取液中除分析物以外常含有很多共提物，为了除去这些干扰物，需要进一步采用SPE净化。在净化中常用的SPE柱有C18、HLB、硅胶、SCX、MCX、Extrelut NT20和XTR等。

A.阳离子交换柱

阳离子SPE柱是本类药物最常用的净化工具，主要采用SCX和MCX柱。

SCX为强阳离子交换柱，质子化的药物分子通过与小柱.上苯磺酸基团相互作用而被保留。SCX对硝基咪唑类药物离子互作力远大于非极性互作力，允许强洗涤溶剂净化。使用SCX柱，则要溶于酸性水相上样，洗脱液选用5%氨水-乙腈溶液，或乙酸乙酯洗脱。Lin等测定猪肌肉中5种硝基咪唑类药物，用SCX净化。乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸-乙酸乙酯(1+19，v/v)复溶后上样，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，最后用氨水-乙腈(1+19，v/v)洗脱，毛细管电泳(CE)检测。LOD为0.3～1.0μg/kg，LOQ为0.9～3.2μg/kg；日内回收率为85.4%～96.0%，CV为1.3%～3.9%；日间回收率为83.5%～92.5%，CV为1.1%～4.2%。Sun等用乙酸乙酯提取禽和猪肉中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ和DMZOH，提取液上scx柱净化，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，用氨水-乙腈(5+95，v/v)洗脱。7种药物的LOD为0.2μg/kg，回收率为71.4%～99.5%。Sams等测定禽蛋中硝基咪唑残留。乙腈提取液用乙酸酸化后用SCX净化，依次用丙酮、甲醇和乙腈淋洗，用乙腈-35%氨水(95+5，v/v)洗脱，HPLC测定。LOD为0.5μg/kg；禽蛋中回收率分别为65%(DMZ)、87%(RNZ)和75%(MNZOH)。高小龙采用HPLC测定蜂蜜和蜂王浆中的RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ。样品提取液经盐酸反萃取后，上SCX柱净化，用3mL水淋洗，除去水溶性物质，最后采用20mL pH8.8的0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱。蜂蜜和蜂王浆中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均为1.0ug/kg，回收率为59.2%～70.06%和54.9%～69.1%，CV分别小于18%和16%。

MCX柱为反相与强阳离子交换混合保留机制的SPE柱。Xia等用MCX柱净化猪肾组织中4种硝基咪唑及其代谢物(MNZ、HMMNI、MNZOH、RNZ、IPZ、IPZOH、DMZ)的乙酸乙酯提取液。提取液蒸干后用盐酸复溶，上MCX SPE小柱，依次用0.1mol/L盐酸，甲醇和5%氨水淋洗，用含5%氨水的甲醇-水(70+30，v/v)洗脱。平均回收率为83%～111%，CV小于12%，LOD和LOQ分别为0.05～0.5μg/kg和0.1～0.5μg/kg。研究发现，改善净化条件也可以降低基质效应，在MCX净化中，洗涤步骤增加2%(v/v)氨水-10%(v/v)甲醇溶液，洗脱步骤增加2%(v/v)氨水-30%(v/v)甲醇溶液可明显降低基质效应。王扬等同时测定鱼肌肉中MNZ、DMZ、ORZ、TNZ和RNZ等5种硝基咪唑类药物残留。提取液过MCX柱，3.0mL水洗柱，3.0mL 2%浓氨水甲醇溶液洗脱。5种硝基咪唑类药物的LOD均为1.0μg/kg，回收率分别为73.3%、74.7%、62.9%、74.4%和80.1%，RSD不大于10%。

B.阴离子交换柱

阴离子交换SPE也有用于硝基咪唑类药物净化的报道。GB/T20744-2006测定蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ残留，乙酸乙酯提取液浓缩后，过Carboxylic acid SPE柱净化，依次用乙酸乙酯和乙腈洗涤，用甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液(40+18+42，v/v)洗脱。MNZ的LOD为0.1μg/kg，DMZ和RNZ为0.2μg/kg；回收率为69.5%～82.4%。

C.正相柱

用正相SPE柱净化硝基咪唑类药物也能起到良好效果。常用的填料主要有硅胶、氨基和硅藻土。Cannavan等建立了DMZ的残留分析技术。肌肉用二氯甲烷提取，鸡肝脏和禽蛋用甲苯提取，提取_上清液直接上硅胶柱净化，二氯甲烷提取液用甲苯淋洗，甲苯提取液依次用二氯甲烷、正已烷淋洗，丙酮洗脱，液质联用仪分析。DMZ内标校正回收率为93%～102%，CV为1.2%～7.7%，绝对回收率约80%。Sakamoto等测定鱼肉和蜂蜜中的DMZ、MNZ和RNZ，乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(3+7，v/v)复溶，用硅胶柱净化，乙酸乙酯洗脱。平均回收率为91.21%～107.0%，CV为1.7%～17.1%，LOD为0.05～0.2μg/kg。Sorensen等将鱼肉中MNZ和MNZOH的乙腈提取液蒸干后，复溶于乙酸乙酯-正己烷溶液(1+2，v/v)中，过硅胶小柱净化，乙酸乙酯-正己烷(1+2，v/v)淋洗，甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脱。MNZ回收率为81%～93%，MNZOH回收率为79%。氨基柱与硅胶柱净化机制相似，分别通过药物的极性基团与氨基或硅醇基相互作用达到保留，但组织中微量的水分对方法的精密度和重复性具有较大影响，因此在净化前加入无水硫酸钠脱水非常关键。Ho等用甲苯提取肌肉、肝脏和肾脏中的MNZ和DMZ，提取液用等体积正已烷稀释后，上氨基固相萃取柱净化，用正己烷淋洗，乙酸乙酯～异丙醇(9+1，v/v)洗脱，气相色谱-质谱(GC-MS)测定。回收率为72%～106%，CV小于13%。DMZ的蒸汽压较高，旋转蒸发和氮气吹干DMZ随溶剂挥发而损失，为防止吹干时DMZ被溶剂带走，考察了DMF、甲酸、三氟乙酸等3种溶剂和蒸发温度对DMZ的保护效果，表明加入保护剂三氟乙酸和二甲基甲酰胺或者蒸发温度降低时，DMZ的回收率增高。三氟乙酸可做保护剂的可能原因时它与DMZ发生反应生成较难挥发的盐。Zhou等分析蜂蜜中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI，提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(2+1，v/v)复溶，氨基柱上加2g无水硫酸钠用于脱水，上样后直接用甲醇-乙酸乙酯(1+4，v/v)洗脱，洗脱液蒸干后用流动相溶解测定。方法LOD为1～2μg/kg，平均回收率在71.5%～101.4%之间。研究还发现，上样溶液中加入非极性溶剂-正已烷，可提高药物与极性固定相的相互作用，增加净化效果和回收率。

Extrelut NT20和XTR的填料是硅藻土(Celite颗粒)，属于正相SPE柱，也可以用于本类药物净化。Polzer等应用Extrelut NT20柱净化畜禽肌肉提取液中的DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、HMMNI、MNZOH和IPZOH。水溶液上样后，用乙酸乙酯-叔丁基甲基醚(1+1，v/v)洗脱。DMZ、RNZ、HMMNI、MNZ和MNZOH的CCa为0.65～2.8μg/kg，IPZ和IPZOH的CCa为5.2～5.3μg/kg；回收率在96%～118%之间。该净化的特点为，所有的脂溶性化合物从水溶液中提取出来进入有机相，而水相则保留在固定相上，流出液无乳化，直接蒸发后用于下一步的分析。

D.反相柱

反相SPE也可以用于硝基咪唑类药物净化，常用的SPE柱有HLB和C18。

Mottier等测定鸡肉和禽蛋中的硝基咪唑类药物，乙腈提取液蒸干后用水复溶，上HLB柱，用3mL水-甲醇(95+5，v/v)淋洗，甲醇洗脱，LC-MS/MS测定。DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、DMZOH、MNZOH和IPZOH的CCa在0.12～1.0μg/kg之间，CCβ在0.22～1.0μg/kg之间。Shen等用乙酸乙酯提取，蒸干后用盐酸溶解，与正己烷LLP脱脂，盐酸溶液上HLB柱净化，甲醇洗脱，HPLC测定。DMZOH、MNZ、RNZ和DMZ的LOD在1.0～2.0μg/kg之间；猪肉的平均回收率为80.1%～83.9%，猪肝为78.9%～82.3%。

高小龙建立了测定鸡可食组织中DMZ和DMZOH残留的HPLC法。鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)匀浆后，用无水硫酸钠和二氯甲烷振荡提取，取有机层浓缩，加水溶解，用正己烷去脂，水层过C₁₈柱，甲醇洗脱，HPLC在320nm检测。DMZ和DMZOH的LOQ均为1μg/kg；肌肉的平均回收率在56.9%～76.5%之间，肝脏在63.3%～72.6%之间，肾脏在64.2%～73.3%之间，脂肪在63.5%～75.7%；日内CV均小于16%，日间CV均小于18%。Gaugain等用C₁₈ SPE净化猪、禽组织中3种硝基咪唑类药物，用5mL乙酸铵缓冲液淋洗，用2mL乙酸铵缓冲液-甲醇(1+3，v/v)洗脱，HPTLC测定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分别为2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。

3)凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，相对分子质量大的组分先流出(即淋洗时间短)，相对分子质量小的后流出(即淋洗时间长)，达到净化目的。我国国家标准GB/T21318-2007测定猪肉、 鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾和鱼肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代谢物MNZOH、HMMNI残留时，取5mL提取液用GPC进行净化。净化柱为GPC Bio Beads SX3(700mm×25mm)，流动相为乙酸乙酯～环已烷(1+1，v/v)，流速为4.7mL/min，弃去先留出90mL淋洗液，再收集接下来90mL流出液，最后再用30mL收集，蒸干后，用甲醇溶解再进一步用C18小柱净化，LC-MS/MS测定。方法LOD在0.5～1μg/kg之间，回收率为71.4%～115%。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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