19.2.1.7 分析条件的选择

(1) 初次净化条件的选择

5种硫脲嘧啶在衍生之前，需要进行净化。如果净化的效果不好，会直接影响衍生化效果。本方法对比了硅胶固相萃取柱(Bond Elut SI 500mg，3mL)和氨基固相萃取柱(NH₂ 500mg，3mL Waters)两种萃取柱的净化效果。试验表明，氨基固相萃取柱净化效果更好一些，因此选择氨基固相萃取柱为净化柱。

(2) 衍生化条件的选择

对比了不同衍生剂用量对测定结果的影响。取一定浓度的5种硫脲嘧啶标准溶液，衍生剂加入量分别为0.25mg，0.5mg，0.75mg，1.0mg，1.5mg，2mg，进行衍生反应并进行测定，响应值和衍生剂用量的关系结果见表19-4。

表19-4 衍生剂用量对测定结果(响应信号峰面积)的影响

从表19-6中看出，当衍生剂加入量少于1.0mg时，可能使被测物衍生不完全，产生比较小的响应信号，本方法选择衍生剂用量为1.5mg。

(3)提取稳定剂的选择

本方法对比实验了三种提取稳定剂及其组合对测定结果的影响，结果见表19-5。

表19-5 不同的提取稳定剂对测定结果(响应信号峰面积)的影响

从表19-7 中可看出，当提取溶液中加入巯基乙醇和EDTA-Na₂溶液作为稳定剂时，五种硫脲嘧啶都有较好的回收率，并且对测定没有干扰。

(4)二次净化条件的选择

一是衍生溶液调pH后用乙醚提取两次，离心合并乙醚层氮气吹干定容。这种方式操作步骤比较复杂，而且乙醚层不能全部移取，影响回收率。有时还会出现乙醚和水相分层不彻底的情况而产生干扰，从而影响结果的准确性。二是采用Oasis HLB (500mg，3mL Waters)固相萃取柱净化，这种方法提取效率和净化效果都较为理想，操作步骤也比较简单，适合于大批量样品的检测。因此，选择Oasis HLB(60mg，3mL Waters)萃取柱作为样品净化柱。表19-6是乙醚提取和固相萃取柱净化两种方法的净化效果对比。

表19-6 乙醚和固相萃取净化效果的对比(响应信号峰面积)

从表19-9中可以看出，用HLB固相萃取柱净化能获得比乙醚萃取更好得响应值。

(5)测定条件的选择

1)液相色谱条件的选择

本方法选取ZORBAX SB-C₁₈(3.5um，150mm×2.1mm)，Atlantis-C₁₈(3um，150mm×2.1mm)和Symmetry-C₁₈(3um，150mm×2.1mm)三种液相分析柱进行实验，三种柱子对五种硫脲嘧啶及内标的检测灵敏度和分离效果进行比较，结果发现，Atlantis-C₁₈分析柱，灵敏度和分离度都较理想。因此，选择该柱为分析柱。

为了优化流动相，对比了甲醇+乙酸水溶液、乙腈+乙酸水溶液做流动相的色谱效果，实验表明，0.1%甲酸乙腈溶液+0.1%甲酸水溶液作为流动相并采用梯度洗脱时，被测物分离度和灵敏度较高。

2) 质谱条件的选择

取五种硫脲嘧啶和内标标准溶液20ug/mL，用NBF-CI衍生化，分别得到NBF-CI-TU，NBF-CI-MTU，NBF-CI-PRTU，NBF-CI-TAP，NBF-CI-MBI和NBF-CI-MEMBI标准衍生溶液。以5μL/min流速分别将净化后的衍生物注入离子源。在正离子检测方式下分别对其进行一级质谱分析(Q1扫描)得到分子离子峰。再对分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到二级质谱图。然后再对去簇电压(DP)、聚焦电压(FP)、碰撞气能量(CE)及碰撞室出口电压(CXP)等参数进行优化，使分子离子与特征碎片离子强度达到最大，确定最佳质谱参数。将液相色谱与质谱联机，对雾化气流量，雾化室温度，喷雾针位置等参数进一步优化，使各种参数达到最佳。

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文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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