北京普天同创生物科技有限公司
(1)提出问题 色谱工作者常会碰到这样的问题,什么时候该换色谱柱了?色谱柱的塔板数能体现色谱柱的状态吗?从经验来看,当一支色谱柱的塔板数降低到新柱子时的百分之几时,就可以认为该色谱柱不能再使用了吗?将塔板数作为评价色谱柱质量的唯一指标合适吗?
(2)分析原因 塔板数是一个粗略的指标,只作为评价色谱柱的参考。通常使用塔板数来考察色谱系统:将新柱子接到仪器上,根据生产商提供的测试条件测试,应该得到和分析报告上同样的结果,一般不应低于报告值90%(塔板数)。如果你所测得的塔板数远远低于厂家提供的报告数据,这就说明你的色谱系统可能存在一些问题。进样器、柱外效应、毛细管连接以及检测器都是容易出现问题的地方。
(3)解决方案 相信每个色谱工作者都会关心分离度,分离度是考察一根色谱柱分离具体样品的好坏程度的指标。色谱的核心任务就是为了使每个峰完成分离,得到有合理峰宽的色谱峰,以便获得较低的检测限。然而,塔板数对分离度的影响仅仅是平方根的关系,当一根色谱柱的塔板数下降50%,分离度仅下降7%。
其实,大多数用户仅仅使用色谱柱塔板数的一小部分。使用下面的公式可以估算一支色谱柱的塔板数:
N=3000L/Dp
式中,L是色谱柱的柱长,cm;Dp 是填料的粒径,um。
在实际的工作中,大多数色谱方法仅仅需要这些塔板数的一半,可见,色谱柱的塔板数不是分离中最重要的参数。
较好的方法是使用压力、分离度和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态。
压力的测量是最容易的,通常我们确定的色谱方法要满足以下的要求:用新柱子时柱压不高于2500psi,在任何情况下压力都不超过3000psi。有统计表明,超过60%的色谱柱损坏是由于压力过高的原因。
分离度是考察色谱柱的一个非常重要的指标,只要两个组分可以获得基线分离,对该分析物的定量就不会有什么问题。对于高斯峰来讲,1.5的分离度即可得到基线分离;若分离度在1.7~2.0则更好。若峰拖尾严重则需要更高的分离度。使用分离度作为色谱柱的评价指标的好处在于我们可以直观地看到相邻的峰的分离情况。
另外一个考察色谱柱质量的标准是峰形拖尾情况,厂家测试报告的峰形都非常漂亮,但这并不代表该色谱柱分析实际样品的情况。
通常,在开发分析方法的过程中,一般会试验几根色谱柱,分析足够多的实际样品,就知道当分离变差时是什么样的情况。在开始时可使用一个宽的范围;如果在开始时紧缩系统适用性要求,在方法认证后再放宽这个要求,是很困难的。在分析实际样品之前进行系统适用性考察,以确保该色谱方法满足分析者可以接受的标准。
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