【实验器材】

(1)仪器 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、pH计、烧杯、磁力搅拌器、容量瓶、盐水瓶、灭菌过滤器、移液器及配套枪头等。

(2)材料滤纸、称量纸、滤膜。

(3)试剂 D一Hank’s液、Hank’s液、EDTA·2Na、NaHCO3或HCl、酚红、新鲜制备的三蒸水、胰蛋白酶粉末等。

【操作方法与步骤】

(一)0．25％胰蛋白酶液的配制

1．配制方法

(1)过滤消毒法

①按实验需要称取胰蛋白酶粉0．25 g，用少量D—Hank’s液将其调成糊状。

②加适量D-Hank’s液(橙红色)，磁力搅拌3～5 d即可溶解(室温和4℃间断进行，室温高于30℃要减少酶液在室温中的搅拌时间)，定容100 mL。

③溶解后的酶液(深红色)用0．22μm微孔滤膜滤过除菌，分装(每瓶1～5 mL)，于-20℃冻存保存。

④用前用无菌NaHCO3调节pH到7．4。

(2)高热消毒法(利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性)

①按实验需要称取酶粉溶于1 mmo]／L pH 3．0的HCl中。

②酶液和2倍D—Hank’s液同时在0．1 MPa，120℃条件下灭菌20 min。

③两液冷却至室温时，等量混匀。酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。然后用10 mol／L的Na0H调消化液pH至7．2(橙红色或深红色)。

④经计算，消毒后酶浓度下降50％。如消毒前酶浓度为0．1％～0．5％，消毒后为0．05％～0．25％。

高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。

2．注意事项

(1)使用过滤消毒法配制胰蛋白酶液时，要注意配制过程中温度要保持在4℃。

(2)胰酶要研磨充分，否则在过滤时会将较大颗粒过滤掉，使浓度降低。

(3)分装时尽量分装多瓶，并遵守3次左右用完和只装2／3的原则。防止冷冻保存时体积膨胀，反复冻融会降低胰酶消化效果。

(二)0．02％EDTA·2Na的配制

1．配制方法

(1)准确称取EDTA·2Na 0．20 g，用一定量无Ca2+、Mg2+ BSS(如D-Hank’s)溶解。

(2)加入酚红15 mg，用无Ca2+、Mg2+ BSS定容至1 000 mL。

(3)用NaHCO3准确调节pH到7．2，用0．22μm微孔滤膜滤过除菌或高压蒸汽灭菌。

(4)分装小瓶(每瓶16 mL)，于4℃保存备用。

2．注意事项

(1)EDTA·2Na一般用于消化传代细胞，且消化能力较弱，一般和0．25％胰蛋白酶液按照体积比1：1混合使用。

(2)使用后的EDTA·2Na不能被血清中和，需要彻底清洗，否则细胞易脱壁，影响细胞生长。

(三)胶原酶液的配制

(1)准确称取所需胶原酶粉(0．1～0．3 mg，视所需浓度而定)，用一定量Hank’s或基础营养液调成糊状。

(2)用Hank’s或基础营养液定容至1 000 mL，置磁场搅拌至基本溶解。

(3)用蔡氏滤器滤过除菌(因为胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤)。

(4)分装小瓶(10 mL)，于-2℃冻存保存备用。