灭菌是组织培养工作的重要内容之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是指凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。所以无菌室等未经处理的地方，我们使用的剪刀、镊子、超净工作台表面、解刮针，简单煮沸的培养基，洗得很干净的器皿表面等，我们身体的整个外表及其与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道等都是有菌的；无菌的范畴是指经一定时间蒸煮或高温灼烧过后的物体，经其他物理或化学灭菌方法处理后的物体，健康动、植物不与外部接触的组织内部，高层大气、化学灭菌剂、岩石内部、强酸强碱等表面和内部等都是无菌的。

植物细胞组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过了微生物的培养要求，是因为培养基中含有高浓度蔗糖，能供养很多微生物如细菌和真菌的生长，一且接触培养基，这些微生物的生长速度一般都比培养的外植体快得多，最终将外植体全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物。因此，在组培实验中稍不小心就会引起杂菌的污染。

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面或者孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。物理方法如湿热(常压或者高压蒸煮)、清洗和大量无菌水冲洗、干热(烘烤或者灼烧)、离心沉淀、射线(紫外线、超声波、微波)、过滤等措施；化学方法是使用抗生素和各种消毒剂例如升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、次氯酸钠、酒精等，在进行灭菌时，必须针对不同的对象采用切实有效的方法。

1．培养基、工作服、口罩、帽子等用湿热灭菌

培养基在制各过程中带有各种杂菌。分装后应立即灭菌。至少应在24 h之内完成灭菌工作。常规方法是放入高压蒸汽灭菌锅内加热、加压灭菌。高压灭菌的原理是在密闭的蒸锅内，因蒸汽压力不断上升，致使水的沸点升高，在1．1 kg／cm2的压力下，锅内温度能达到121℃，而在121℃的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢，这些芽孢在100℃的沸水只能生存数小时。一般少量的培养基只要20 min就能达到彻底灭菌，如果灭菌的培养基量大，就应适当延长灭菌时间。

灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。在使用高压蒸汽压力锅时，注意安全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底，高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保正灭菌彻底。常用方法是关闭放气阀，待压力上升到0．05 MPa时，打开放气阀，放出冷空气，待压力表指针归零后再关闭放气阀，压力表义重新上升到0．1 MPa时，开始计时，压力0．1～0．15 MPa维持20 min，不能随意延长时间和增加压力。培养基要求比较严格，严格遵守保压时间，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，琼脂在长时间灭菌后凝固力也会下降，以致不凝固。达到保压时间后，当冷却被消毒的培养基溶液时必须十分小心，在压力降低到0．05 MPa时，可缓慢放出蒸汽。如果压力急速下降超过了温度下降的速度，就会使液体沸腾，从培养容器中溢出。当高压灭菌锅的压力表指针降到零后，才能打开灭菌锅，取出培养基，置于超净工作台上的无菌条件下使之冷却，不论是固体培养基还是液体培养基，均应分装在较小的器皿中加塞封口。

对高压后不变质的物品，如栽培介质、接种用具、无菌水、工作服、口罩、帽子等布制品可以延长灭菌时间或提高压力，洗净晾干后用耐 高压塑料袋装好，高压灭菌30 min。

高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖。从而改变培养基的渗透压，在8％～20％蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基渗透压约升高0．43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使得15％～25％的蔗糖水解为葡萄糖或果糖。培养基中添加0．1％活性炭时，高压下蔗糖水解也会增强。

2．金属器械可采用灼烧灭菌

对于无菌操作所用的各种器具，如打孔器、镊子、解剖刀、剪刀、解剖钭等，一般的消毒办法是把它们先浸泡入95％的酒精中，使用之前取出再以火焰将酒精灼烧灭菌，待冷却后立即使用。操作可采用250 mL或500 mL的广口瓶，放入95％的酒精以便插入工具。这些器具不但在每次操作开始前要这样消毒，在操作期问也还要再消毒几次。也可将擦净或干燥的金属器械用纸包好或盛于铁盒内在120℃的烘箱内处理2 h，或用布包好后放在高压灭菌器内灭菌。

3．玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌，若培养基已先灭菌，而只需单独进行容器灭菌时，可采用干热灭菌法，将洗净的培养器皿等置入烘箱中，加热到160~180℃的温度来杀死微生物，达到灭菌目的。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常180℃持续3 h来灭菌。干热灭菌的缺点是热空气循环不良和穿透很慢，因此不应把玻璃容器在烘箱内放得太挤；干热灭菌的物品预先清洗并干燥，工具要包扎，以免灭菌后取用时重新污染；包扎可用耐高温的塑料，灭菌时应该逐渐升温，达到预定温度后记录时间，灭菌后须待烘箱充分冷凉后才能打开烘箱，如果尚未足够冷却即急于取出，外部的冷空气就会被吸入烘箱，因此有可能使里面的玻璃器皿重新受到微生物污染，甚至还有发生炸裂的危险。

4．不耐热的物质采用过滤灭菌

某些生长调节物质如赤霉索、玉米素(zeatin)、多糖、脱落酸、秋水仙素(cotchicine)、尿素以及某些维生素如维生素B1、维生素B12、维生素C、泛酸等，遇热时容易分解，使其结构容易遭到破坏，不能利用高温高压进行灭菌，通常采用过滤灭菌法，然后冉将其加入高压灭菌过的培养基中。如果要制备一种半固态培养基，须待培养基冷却到大约40℃时再加入这种无菌的热分解化合物；如果是要制备一种液体培养基，则要待培养基冷却到室温后再加。过滤灭菌法应该先选择0．65μm滤膜进行初滤可减少0．4 μm滤膜过滤器微孔的堵塞，从而使过滤灭菌进行得比较通畅。

过滤法灭菌的晕本原理是将带菌的液体或气体通过网孔直径小于0．45μm微孔滤器装置，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞核、真菌的孢子等因为大于滤膜直径而被阻挡在滤膜上，液体、气体可通过滤膜流入无菌瓶中。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。

5．空间采用熏蒸和紫外线灭菌

(1)熏蒸灭菌 采用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋自质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般来说，温度越高，作用时间越长，杀两效果越好；另外由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾，还有消毒剂量的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，将甲醛放置在广口容器中，加5 g／m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时房间预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。

接种室内灭菌除定期用甲醛及高锰酸钾熏蒸外，使用前可用2％新洁尔灭擦净，并用70％酒精喷雾，然后再用紫外灯照射。

(2)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异而造成死亡。紫外线的波长为200～300 nm，其中以260 nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求照射物以不超过1．2m为宜。

6．一些物体表面用药剂喷雾灭菌

物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如墙面、桌面、双手等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％～2％的来苏儿溶液以及0．25％～1％的新洁尔灭也可以。

7．植物材料表面用消毒荆灭茵

植物材料的消毒一般都是采用化学灭菌的方法。从外界或室内选取的植物材料的表面都不同程度地携带着各种污染微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染，为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须进行彻底的表面消毒，灭菌所用的浓度、消毒时间因不同材料而定，应该灵活运用并不断总结经验；对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等，在消毒前，一般先用肥皂水洗净，自来水冲净，再在70％酒精或1 mol／L盐酸中提30 s而侵入消毒剂；消毒剂中可加数滴吐温20，以增强消毒剂的效果。内部已受到真菌或细菌侵染的部分在组织培养研究中一般都要淘汰。或者先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其各个部分如根段、茎段和叶片等建立组织培养。植物材料的灭菌具体见本章第四节外植体的灭菌。