一、概述

紫外可见分光光度法是根据物质分子对波长为200一780nn范围的电磁波的吸收特性建立的一种定性、定量和结构分析方法。该法操作简单、准确度高、重现性好。长波长（频率小）的光线能量小，短波长（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。

描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。紫外一可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。1852年，比尔（Beer）参考了布给尔（Bouguer)1729年和朗伯（Lambert）在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，也就是著名的比尔一朗伯定律（Beer一Lambertlaw)，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔一朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为l，浓度为c的吸光物质时，由于介质吸收了一部分光能，透射光的强度就要减弱。吸收介质的浓度越大，介质的厚度越大，则光强度的减弱越显著。其关系为：辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为：

A＝log I0/I1＝log 1/T＝Klc

式中：A—吸光度；

I0—入射辐射强度；

I1—透射光的强度；

T－透射比，或称透光度；

K—系数，可以是吸收系数或摩尔吸收系数；K值越大，分光光度法测定的灵敏度越高；

l—吸收介质的厚度，一般以cm为单位；

c—吸光物质的浓度，单位可以是g/L或mol/L,

当介质中含有多种吸光组分时，只要各组分间不存在着相互作用，则在某一波长下介质的总吸光度是各组分在该波长下吸光度的加和，这一规律称为吸光度的加合性。
比尔一朗伯定律的成立是有前提的，即：

（1)入射光为平行单色光且垂直照射；

(2）吸光物质为均匀非散射体系；

(3)吸光质点之间无相互作用；

(4）辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。

根据比尔一朗伯定律，当吸收介质厚度不变时，A与c之间应该成正比关系，但实际测定时，标准曲线常会出现偏离比尔一朗伯定律的现象，有时向浓度轴弯曲（负偏离），有时向吸光度轴弯曲（正偏离）。造成偏离的原因是多方面的，主要是测定时的实际情况不完全符合使比尔一朗伯定律成立的前提条件。物理因素有：①非单色光引起的偏离；②非平行入射光引起的偏离；③介质不均匀引起的偏离。化学因素有：溶液浓度过高引起的偏离和化学反应（如水解、解离）引起的偏离。

可见光范围内分光光度法测定时选择的光的颜色（波长）为被测物所显示颜色的互补色。

二、紫外可见分光光度计

1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等将比尔-朗伯定律应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外一可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。紫外一可见分光光度计由5个部件组成。

(1)辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350一2500nm),氖灯或氢灯（180一460nm)，或可调谐染料激光光源等。

(2)单色器。由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。

(3)试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.5一10cm。

(4）检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。现在还使用光导摄像管或光电二极管矩阵作检测器，具有快速扫描的特点。

(5)显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。

分光光度计仪器类型有单波长单光束直读式分光光度计，单波长双光束自动记录式分光光度计和双波长双光束分光光度计。

三、紫外-可见分光光度法应用

紫外-可见分光光度法应用范围广泛，包括：①定量分析，广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。②定性和结构分析，紫外吸收光谱可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。③反应动力学研究，即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系，测定反应速度和反应级数，探讨反应机理。④研究溶液平衡，如测定络合物的组成，稳定常数、酸碱离解常数等。紫外一可见分光光度法应用很普遍，以下是一些与食品分析相关的应用实例。

(1)饮料中的咖啡因含量测定。采用三氯甲烷为萃取剂，控制三氯甲烷与饮料的体积比为8:1，经充分振荡后离心分离，取清液在276nm处测定紫外吸收光谱，能够满意地测定市售饮料中的咖啡因浓度，分析结果的相对标准偏差小于4%；在饮料中加入不同浓度的咖啡因标准溶液，回收率在94.0％一112.0%之间。

(2）藤茶中总黄酮测定。以乙醇为溶剂提取藤茶中总黄酮，用三氯化铝作为显色剂，采用三波长紫外光谱法进行定量。结果表明，黄酮质量浓度在0一40μg/mL内，分别在波长为λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm处测吸光度时，△A与质量浓度C之间呈良好的线性关系，相关系数r=0.9978。方法的回收率为98.18％一102.79%，变异系数小于0.371%。

(3）金银花提取物中有机酸含量测定。以高效液相色谱法（HPLC)为参照，测定金银花提取物中绿原酸、咖啡酸、3,4一咖啡酰奎宁酸、3,5一二咖啡酰奎宁酸、4,5一二咖啡酰奎宁酸的含量。在220-400nm范围内扫描金银花提取物溶液的紫外吸收光谱，采用偏最小二乘法分别建立样品紫外吸收光谱与5种有机酸含量之间的校正模型。5个校正模型对预测集样本的预测值与对照值的相关系数都在0.90以上，相对预测误差分别为1.46%，-2.13%,0.42%,6.40%,3.83%，预测结果准确。