一、原理

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠一乙酸缓冲溶液中与乙酞丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

二、试剂和材料

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

(1）硫酸铜(CuSO4·5H2O)。

(2）硫酸钾(K2SO4）。

(3）硫酸(H2SO4密度为1.84g/L)：优级纯。

(4)氢氧化钠(NaOH)。

(5）对硝基苯酚(C6H5NO3）。

(6）乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。

(7）无水乙酸钠(CH3COONa)。

(8）乙酸(CH3COOH)：优级纯。

(9)37％甲醛(HCHO)。

(10）乙酰丙酮(C5H8O2）。

(11)氢氧化钠溶液(300g/L)：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

(12）对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L)：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95％乙醇中，加水稀释至100mL。

(13）乙酸溶液(1mol/L)：量取5.8mL乙酸，加水稀释至100mL。

(14）乙酸钠溶液(1mol/L)；称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠，加水溶解后并稀释至500mL。

(15）乙酸钠一乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液与40mL乙酸溶液混合，该溶液pH=4.8。

(16）显色剂：15mL甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀(室温下放置稳定3d)。

(17)氨氮标准储备溶液(以氮计）(1.0g/L)：称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mg氮。

(18)氨氮标准使用溶液(0.1g/L)：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液于100mL容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。

三、仪器和设备

(1)分光光度计。

(2）电热恒温水浴锅：100℃±0.5℃。

(3)10mL具塞玻璃比色管。

(4）天平：感量为lmg。

四、分析步骤

1.试样消解

称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1-0.5g(精确至0.001g)、半固体试样0.2一1g(精确至0.001g）或液体试样1一5g(精确至0.001g)，移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45℃角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。

2.试样溶液的制备

吸取2.00-5.00mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1一2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

3.标准曲线的绘制

吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液(相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮），分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠一乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热巧min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。

4.试样测定

吸取0.50-2.00mL约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。以下按3.2.3.3自“加4mL乙酸钠一乙酸缓酸溶液(pH=4.8)及4mL显色剂……”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。

5.分析结果的表述

试样中蛋白质的含量按式(3-2)进行计算。

X＝(c-c0)/[m×(V2/V1)×(V4/V3)×1000×1000]×100×F．．．．．．．．．(3一2)

式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g;

C—试样测定液中氮的含量，μg;

C0—试剂空白测定液中氮的含量，μg;

V1—试样消化液定容体积，mL;

V2—制备试样溶液的消化液体积，mL;

V3—试样溶液总体积，mL;

V4—测定用试样溶液体积，mL;

m—试样质量，g;

F—氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

6.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。