四环素族抗生素残留量检验 |
| 作者： 更新时间：2008-3-5 18:29:09 |
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| 肉与肉制品 四环素族抗生素残留量检验 1 主题内容与适用范围 本标准规定了肉和肉制品中四环素族抗生素残留量的检验方法。 本标准适用于肉和肉制品中四环素族抗生素残留量的检验。 2 引用标准 GB 9695.19 肉与肉制品 取样方法 3 原理 四环素族(四环素、土霉素、金霉素)抗生素具有很强的抑菌作用。在接有特定微生物的平板培养基上放入牛津杯,在牛津杯内加满试样溶液,培养后测量抑菌圈的大小。 4 试剂与培养基 4.1 试剂： 4.1.1 磷酸盐缓冲液(pH4.5): 精确称取磷酸二氢钾(GB 1274,分析纯) 13.6g,溶解于蒸馏水中,定容到1000mL,高压灭菌115℃, 30min,冷却后置4℃冰箱内保存。 4.1.2 生理盐水称取氯化钠(GB 1266) 8.5g溶解于1000mL蒸馏水中,高压灭菌115℃,30min。 4.1.3 盐酸(GB 622): 0.1mol/L溶液。 4.1.4 标准四环素原液 : 精确称取四环素50mg, 用0.1mol/L盐酸 1mL溶解,用水定容到1000mL,在4℃冰箱中可保存一周。 4.2 培养基： 4.2.1 菌种培养基： 胰蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 氯化钠(GB 1266) 2.5g 琼脂 14.0～16.0g 蒸馏水 1000mL 将以上成分加热溶解,高压灭菌121℃15min,最终pH6.5±0.1。 4.2.2 检定用培养基： 胰蛋白胨 6.0g 牛肉膏 1.5g 酵母膏 3.0g 琼脂 14.0～16.0g 蒸馏水 1000mL 将以上成分加热溶解,高压灭菌121℃15min,最终pH5.8±0.1。 5 仪器和设备 5.1 培养皿：内径90mm,底部平整光滑,具陶质盖。 5.2 牛津杯：内径6±0.1mm,外径7.8±0.1mm,高度10±0.1mm。 5.3 游标卡尺：测量抑菌圈直径用。 5.4 均质器。 5.5 离心机。 5.6 恒温水浴。 5.7 恒温培养箱。 5.8 电热干烤箱170±0.1℃。 6 试样 6.1 按GB 9695.19取样。 6.2 至少取有代表性试样200g,用绞肉机绞2次混匀,放在封闭容器中干冰箱内贮存备用,试样要尽快分析。 7 分析步骤 7.1 检样液的制备 称取试样10.0g,加入0.1mol/L磷酸缓冲液20mL小心搅匀放置60min。然后于均质器中均质(3000～6000r/min) 1 min,经4000r/min离心10min,其上清液为检样液。 7.2 菌液和检定用平板的制备 7.2.1 菌液的制备 菌种：蜡样芽孢杆菌(Bac cereus ATCC 11778)由卫生部药品生物制品检定所提供。 将菌种移种于盛有300mL菌种培养基的克氏瓶中,于30 ℃培养箱中培养7天。镜检芽孢数达到85％以上,用生理盐水25mL洗下菌苔,置65℃恒温水浴中加热30min,离心(2000r/min) 20min,弃去上清液,如此重复洗涤芽孢悬液三次。再置于65℃恒温水浴加热30min,然后取生理盐水50mL制成芽孢悬液。置4℃冰箱中可保存一个月。 7.2.2 蜡样芽孢杆菌悬液用量的测定 在实际检定前先试几个平板,即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用培养基中,使0.05μg/mL浓度的标准四环素溶液可产生12mm以上的清晰、完整的抑菌圈作为最适芽孢用量。一般用量为每100mL检定用培养基内加芽孢悬液0.5～1.0mL,1.0mL菌悬液中含芽孢数约为10**6。 7.2.3 检定用平板的制备 将适量芽孢悬液加入溶化后冷却至55～60℃的检定用培养基中混匀。每个平皿内加入培养基6mL,前后摇动平皿,使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平皿表面,置水平位置上盖上陶质盖,待冷凝固后,于每个平板的培养表面放置6个牛津杯,使牛津杯在半径为2.8cm的圆面上成60度角的间距。所用平板须当天制备。 7.3 检定 7.3.1 标准曲线的绘制 四环素稀释液 : 取原液用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释成0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800μg/mL的标准溶液(当天用当天稀释)。 取检定用平板18个,分成6组,每组3个平板作为平行试验。第一组于每个平板的6个牛津杯中分别加满0.025μg/mL的标准溶液作为对照组。第二到第六组于每个平板上的6个牛津杯中,间隔加满0.200μg/mL的标准溶液作为参考。各组余下的牛津杯,根据组别顺序依次加满0.050、0.100、0.200、0.400、0.800μg/mL的标准溶液,经培养后,以各组抑菌圈直径的校正平均值绘制标准曲线。抑菌圈直径校正值(mm)等于2～6组(0.200μg/mL)抑菌圈直径的平均值减去各组抑菌圈直径平均值。用此校正值校正0.050、0.100、0.200、0.400、0.800μg/mL标准溶液的抑菌圈直径平均值。 校正后的值,包括0.200μg/mL浓度的平均值在半对数坐标纸上作图,以抑菌圈直径为横坐标(算术级),以浓度为纵坐标(对数级),通过下列公式绘出标准曲线 L = (3a+2b+c-e)/5 H = (3e+2d+c-a)/5 式中：L——标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径；a、b、e相应浓度是0.050、0.100、 0.800μg/mL。 H——标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径；a、d、e相应浓度是0.050、0.400、 0.800μg/mL。 c——参考浓度(0.200μg/mL)的45个抑菌圈直径的平均值。 7.3.2 试样中四环素族抗生素残留量的检定 每份试样取3个检定用平板,在每个检定用板上,间隔的3个牛津杯内加满四环素标准参考浓度溶液。另外3个牛津杯加满被检试样液,将陶质盖重新盖好,置30±1℃培养箱中,培养17±1h。除去牛津杯翻转平板,精确的测量产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)。分别求出3个检定用平板上参考浓度和被检试样抑菌圈直径数值校正后,从四环素标准曲线上查出被检试样中四环素的含量 |
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