ELISA测定牛奶、猪血浆和猪尿中的磺胺二甲嘧啶 |
| 作者：中国标准物质网 更新时间：2008-7-26 14:52:03 |
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提要 用兔抗磺胺二甲嘧啶抗血清，建立了测定磺胺二甲嘧啶的ELISA法，测定线性范围为(0.05～5.0) μg/L，最低检出浓度为0.025 μg/L。方法回收率全牛奶与脱脂牛奶分别为(82.1%～128.8)%和(90.6%～124.0)%，猪血浆为(84.9%～103.8)%，猪尿为(89.7%～122.4)%。方法简便快速，重现性好，检出限低。
DETERMINATION OF SULPHADIMIDINE RESIDUES IN MILK，SWINE PLASMA AND SWINE URINE BY ELISA
Yang Hong
(School of Pharmacy, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT A competitive enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA) was established with aid of self-made rabbit antibody against sulphadimidine(SM2) for determination of SM2 in milk,swine plasma and swine urine. The dynamic range of determination was 0.05～5.0 μg/L with a detection limit of 0.025 μg/L,much better than the limit obtained by the analogous literature(1～10 μg/L) and well below the European maximum permitted amount of SM2 in milk and pork (25 μg/kg). The recovery values obtained by standard addition to whole milk and skimmed milk were found to be in the range of 82.1%～128.8% and 90.6%～124.0%,respectively,to swine plasma to be 84.9%～103.8%,and to swine urine to be 89.7%～122.4%.No positive samples were found from 270 collected milk samples by the developed ELISA method.
Key Words Sulphadimidine Enzyme linked immuno-sorbent assay Sulphonamide Milk Swine plasma Swine urine
磺胺二甲嘧啶(sulphodimides, SM2)是应用广泛的抗菌药，也用作饲料添加剂，以提高奶牛、生猪的抗病能力和提高产奶量和产肉量。SM2在牛奶或猪肉中的残留量超过一定值将有害消费者健康，如可能引起甲状腺癌［1］。欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μg/kg，磺胺类药物总量不得超过100 μg/kg［2］，国内尚无具体规定。测定SM2的常用方法，有HPLC、GC、TLC法，但试样的预处理及测定操作繁琐，费用高，微生物法简便，但灵敏度和特异性低［3］。酶联免疫吸附分析(ELISA)简便、快速，虽有用于牛奶［2，4］、猪血浆和猪尿［5］等试样中测定SM2的报道，但该方法更为灵敏。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
酶标测定仪(芬兰，Labsystem)；酶标板自动洗涤仪(奥地利，812 SW1)；96孔酶标板(丹麦，Nunc)。兔抗SM2抗血清自制(稀释度为1∶10 000，与16种磺胺类药物和8种抗菌药物的交叉反应都很小，如结构与SM2仅相差一个甲基的磺胺甲基嘧啶交叉反应率仅为5.2%，见表1。表明所用抗血清特异性强。酶标记物制备用的SM2-羧酸衍生物系捷克Dr.Biosfor馈赠，其余试剂为分析纯或Sigma或Serva产品。
1.2 酶标记物的制备
用改进的活化酯法将SM2-羧酸衍生物与辣根过氧化物酶共价交联［6］，过Sephadex G-25柱除盐，用0.01 mol/L NaHCO3作洗脱液，收集第一峰，加等体积甘油，-20℃存放。
1.3 对照液的制备
将SM2对照品用甲醇配成100 mg/L，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释成1 000 μg/L的贮备液。将贮备液用PBS制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的对照溶液。
1.4 标准曲线及样品测定方法
1.4.1 采用竞争法 用包被液(pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲溶液)稀释抗血清，每孔200 μl包被酶标板，室温过夜，用PBST(含Tween 20的PBS)洗涤3次后，制备标准曲线时每孔加入100 μl对照液，样品测定时则每孔加入100 μl用PBS稀释至1∶100的牛奶试样，或稀释至1∶400的猪血浆试样，或稀释至1∶1 000的猪尿试样和100 μl用PBS稀释的酶标记物，水平振荡1 min，室温温育1 h。酶标板洗涤3次，加入200 μl显色液(10 g/L 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺100 μl、60 g/L H2O2 10 μl、pH 5.5的2.0 mol/L乙酸-柠檬酸混合缓冲溶液500 μl和重蒸水10 ml混合制得)，水平振荡15 min显色，加2 mol/L H2SO4 100 μl终止显色，于酶标测定仪上读取吸光度A450nm。将标准溶液浓度对吸光度作成标准曲线。
1.4.2 牛奶试样测定 采集捷克市售牛奶试样270个，每份约20 ml，盛于封口小塑料瓶中，-20℃存放。1周内用ELISA测定，室温自然解冻，混匀后取50 μl，用PBS稀释至1∶100，每个试样平行测定4孔，得到平均吸光度值后从标准曲线求得SM2浓度。
1.5 回收率实验
采集14个不含SM2的全奶试样，其中7个离心脱脂成脱脂牛奶，另7个仍为全奶；采集不含SM2的8个猪血浆和8个猪尿试样。均加入SM2对照液，制成含SM2浓度分别为10、50、250 μg/L的牛奶试样，含SM2浓度分别为80、200 μg/L的猪血浆试样和含SM2浓度分别为200、1 000 μg/L的猪尿试样。混匀后室温放置1 h，用PBS稀释成1∶100牛奶稀释液，1∶400猪血浆稀释液和1∶1 000猪尿稀释液。按“1.4”中方法测定。各试样中SM2浓度由同一酶标板得到的标准曲线求得，然后计算回收率(表2、3、4)。
2 结果与讨论
2.1 ELISA实验条件优化和分析特性
用方阵滴定法优选ELISA的实验条件，抗血清用包被液稀释至1∶10 000，酶标板每孔200 μl，室温包被过夜。酶标记物用PBST稀释至1∶200 000，每孔加100 μl。
图1为SM2加入PBS或加入用PBS稀释至1∶100的全奶或脱脂牛奶中分别求得的3条ELISA标准曲线。可见3条曲线靠近，表明全奶或脱脂奶经1∶100稀释后基本上不存在基质效应的影响，全奶与PBS的标准曲线基本重合，故全奶试样中的SM2浓度可以直接从PBS的标准曲线读出。1∶400稀释的猪血浆和1∶1 000稀释的猪尿均类似，SM2浓度也可以直接从PBS的标准曲线读出，基本上不存在基质效应影响。
免疫分析竞争法的灵敏度可由竞争抑制曲线(未绘出)中50%抑制率所对应的浓度求出［7］，该法灵敏度约为0.2 μg/L。最低检出浓度可由标准曲线中零浓度点吸光度标准差的3倍求得对应的浓度，由图1可求得最低检出浓度约为0.025 μg/L，远低于欧盟允许浓度(25 μg/L)和其它文献［(1～10) μg/L］［2，4，5］，该方法更为灵敏。由于灵敏度高故可通过较高倍数稀释排除试样基质的干扰，又能保证稀释后测定的浓度仍在标准曲线范围内。
2.2 牛奶试样测定结果
测定270个牛奶试样，没有SM2浓度超过25 μg/L的最高允许值者。最高值为20.8 μg/L，最低值为0，均值为4.82 μg/L。采集后立即测定同冷冻1月测定，结果无显著性差异(P＞0.5)。
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