一、荧光分析仪器

一般荧光测定的仪器有荧光光度计和荧光分光光度计，它们一般由激发光源、单色器、试样池、光检测器及读数装置等部件所组成。

1．光源

(1)弧光灯和白炽灯高压氮灯是目前荧光分光光度计应用最广泛的一种光源，这种放电灯外套为石英，内充氨气，它在400-800nm波长范围内提供连续的光输出，在450nm附近和800nm以上有许多锐线，在波长短于280nm的光谱区，其输出强度迅速下降。

氙灯室温下其压力为0.5MPa，工作时压力为2MPa，这种高压状态下存在着爆裂的危险，安装和操作时应注意防护。工作时，氙灯灯光很强，其射线对眼睛有损害，应避免直视光源。氙灯使用寿命大约为2000h，目前，长寿命的氙灯约为4000h。氙灯启动时需要20-40kV的高压脉冲，操作时应注意安全。

新近推出的闪烁式氙灯，特别适用于光敏性试样的测定。此外，结合相应的信号处理技术，可在试样暴露于日光的情况下测定荧光强度。

汞灯是利用汞蒸气放电发光的光源，分为低压汞灯和高压汞灯两种。低压汞灯发射非常敏锐的汞的线状光谱，能量主要集中在紫外光区，它主要用来校正仪器的波长读数。高压汞灯由于汞蒸气压力增大，汞蒸气放电的光谱由线状光谱转为略呈带状的光谱，其中365.0nm线最强。滤光片式荧光计多采用它作为激发光源。

为了弥补氙灯和汞灯各自存在的缺陷，出现了高压汞一氙弧灯。这种灯在紫外光区的发射比氙灯强得多，氙气的存在又提供更宽的光谱输出，不过输出的平滑度远不如氛灯。

石英一钨卤灯这种白炽灯在光谱的可见光区和红外光区提供连续的输出。因为在400nm以下的输出能量低，不能用以激发紫外吸收的荧光体，故在以往的荧光分析中没有使用。不过，随着红区及近红外荧光探针的应用日益增多，预计这类光源的应用也将日益增多。

(2）固态光源有些小型、简便的仪器以发光二极管或激光二极管作为光源。这类光源价廉，操作时只需要很小的能量，产生很小的热量。发光二极管只能提供一小段光谱区的输出，要提供430-680nm波长范围的激发光，需要备有多个发光二极管。与发光二极管相反，激光二极管发射单色辐射，目前已有商品化630-1500nm范围内所需波长的激光二极管。

(3)激光光源激光光源强度大，单色性好。采用激光光源可大大提高荧光测定的灵敏度。激光光源的运用，使荧光分析法实现了单分子检测的目标，把荧光分析技术推向一个新的高度。

2．光栅单色器和滤光片

(1)光栅单色器大多数荧光分光光度计来用光栅作为单色器。光栅有平面光栅和凹面光栅。平面光栅多采用机械刻制，凹面光栅常采用全息照相和光腐蚀而制成。机刻光栅不完善，杂散光较大，可能存在光栅的“鬼影”。

光栅对不同波长光子的通过效率不一致，是造成荧光的激发光谱和发射光谱变形的原因之一。光栅单色器的透射比为波长的函数，机刻光栅输出的最强光的波长称为闪耀波长，荧光分光光度计多选用闪耀波长落于紫外光区（例如300nm）的单色器为激发单色器。由于大多数荧光体的荧光位于400-600nm光区，因而发射单色器常采用闪耀波长为500nm左右的光栅。全息照相的光栅，线槽不完善程度小得多，它没有闪耀波长，对光的波峰的透射效率低于平面光栅，但效率分布的波长范围却较宽。

光栅单色器有两个主要性能指标，即色散能力和杂散光水平。对于荧光测量来说，单色器的杂散光水平是一个极关键的参数。荧光体的荧光一般都很弱，通过激发单色器的长波长的杂散光很容易干扰荧光的检测。特别是许多生物试样都有较大的浊度，导致入射的杂散光被试样散射而干扰荧光强度的测量。

对于发光测量来说，光栅的分辨率一般影响不大，由于发射光谱很少具有线宽小于5nm的峰。狭缝宽度越大，所获得的信号强度越大，信噪比提高，然而分辨率下降。

值得指出的是，当记录某种溶液的发射光谱时，人们往往可能在双倍于激发波长的位置观察到一个发射峰，这是由激发单色器的二阶透射造成的。

(2)滤光片汞灯或白炽灯作光源的荧光光度计，采用两个滤光片，第一滤光片用来选择所需的激发光，第二滤光片用来滤去各种杂散光和杂质所发射的荧光。用滤光片作单色器时，以干涉滤光片的性能最好，它具有半宽度窄、透射比高、经得起强光源的长期照射等优点。对于荧光分光光度计，测量的主要误差是来自单色器的杂散光和试样溶液的散射光。为消除这些误差来源，往往可以通过附加滤光片以弥补单色器的不足。

3．试样池

试样池通常是一只长、宽各为1cm的柱型石英液池。当与流动注射分析技术联用时，则应配置石英微流通池。

4．光检测器

(1)光电倍增管（(PMT）目前几乎所有常规的荧光分光光度计都采用光电倍增管作为检测器。在一定的条件下，PMT的电流量与入射光强度成正比。虽然PMT对各个光子有响应，然而通常测量的是众多光子脉冲响应的平均值。PMT工作时，要求其高压电源很稳定，以保证它对入射的光强度有良好的线性响应。

PMT的光谱响应取决于用作PMT的透明窗口和光阴极的材料。商品仪器中所配置的PMT大多数是蓝敏的，即对紫外光、蓝光和300-500nm的光线比较敏感。需要测定波长在600nm以上的荧光时，则需要采用具有不同光阴极材料的红敏PMT。由于光栅单色器和PMT对不同波长的光并不具有同样的响应，因此，所测得的荧光的激发和发射光谱就会受到歪曲，需要加以校正才能获得真实的光谱。

(2)CCD检测器电荷藕合器件（charge-coupleddevice,CCD）是一种多通道检测器，具有光谱范围宽、灵敏度高、噪声低、线性动态范围宽和可获得三维图像的优点。CCD有线阵和面阵两种形式，前者获取的信息量少，不能处理复杂的图像，但处理信息的速度快，后续电路简单；后者获取的信息量大，能处理复杂的图像。但处理信息速度慢，价格较昂贵。

采用CCD检测器检测时，发射单色器的出口狭缝可以取消。分析物的荧光从入口狭缝进入单色器经分光后，以一连续谱带照射到CCD光敏区，取阵列像素累加后的光致电荷输入计算机处理，即可得到分析物的荧光光谱。在低光强度的激发条件下，CCD检测的灵敏度可比PMT提高数倍，因此特别有利于容易引起光漂白的生物试样的测定。CCD检测器具有连续对荧光光谱多次采集并得到强度一波长一时间三维图谱的功能，很适合用于荧光反应动力学的研究。此外，CCD已在荧光显微镜上得到广泛的应用。

5．读数装置

以往荧光分光光度计的读数装置有数字电压表、记录仪和阴极示波器等几种。数字电压表用于例行的荧光强度测定，既准确、方便又便宜。记录仪多用于扫描激发和发射光谱。记录仪记录笔的响应时间一般为0.1-0.5s。阴极示波器显示的速度比记录仪快得多，可是质量好的阴极示波器其价格比记录仪高得多。

目前，性能较好的商品化荧光分光光度计都由微机控制，并配有相应的软件，可按指令进行波长的自动扫描，数据处理，并在屏幕上直接显示所要求的各种图谱。

二、磷光分析仪器

磷光分光光度计的基本部件与荧光分光光度计类似，因而，如果试样只发磷光，可在荧光分光光度计上直接加以测定。倘若试样也发荧光而干扰磷光的测定时，通常必须借助荧光与磷光寿命的差别，在荧光分光光度计上配上适当的附件（一种称为“磷光镜”的机械装置）将荧光隔开后，便可用于磷光的测定。比较先进的方法是采用脉冲光源和门控检测技术的时间分辨分光光度计、

低温磷光测定一般是在液氮温度下进行的，因而必须附加低温冷冻装置，整个试样池的构造也有所不同。为适应固体表面室温磷光分析，试样室也得作相应的改变。

1．磷光镜

用于低温磷光分析的液池和磷光镜的构造简图。其中，磷光镜是用来调制来自光源的入射光和来自试样所发射的磷光。当转动磷光镜时，这种调制是周期性和异相的，以致在第一相的期间内，散射光和试样的发光均被隔离而到达不了检测器；而在第二相的期间内，激发光被隔断，荧光因寿命极短而立即消失，此时唯有长寿命的磷光到达检测器而被测定。

磷光镜是一个滚筒式的空心圆筒，在其圆周面上有两个以上的等距的狭缝，当电动机带动圆筒旋转时，入射光交替地照射到试样池，而由试样发射的光也交替（但与入射光异相）地到达发射单色器的入口狭缝。当磷光镜转动到既遮断入射光又使其狭缝对准发射单色器的入口狭缝的瞬间，随着入射光被遮断，散射光和荧光随即消失，检测器上便只测量到磷光的信号。磷光镜虽然有多种形式，但其作用原理是一样的。

2．试样池

在低温磷光分析中，通常将试液装入内径约1-3mm的石英细管（液池）中，然后将液池插入盛有液氮的杜瓦瓶内。

固体表面室温磷光分析，是基于测量室温下吸附于固体表面的分析物所发射的磷光。最常用的吸附载体是滤纸，将它裁剪成合适的大小并贴附在玻璃载片上，然后在滤纸中心的合适位置上滴加极小量的试液，适当烘干后再滴加所需要的试剂溶液，再经适当烘干，然后将载片放入试样室，使载片附有试样的一面与入射光的方向成45°，并且滤纸上的试样点必须落在入射光的照射范围内。