体积排阻（Size Exclusion）层析

也称分子筛、凝胶过滤层析或凝胶渗透层析。其工作原理是利用蛋白质分子量或分子形状的差异实现分离。

体积排阻层析柱的柱床由多孔介质填料组成，当样品从层析柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒而迅速洗脱，小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒内，其在凝胶内部的迁移被延迟。因此，蛋白质从柱中被洗脱的顺序一般按分子量由高到低。体积排阻层析主要用来从蛋白质溶液中去除低分子量的缓冲液成分和盐。

(1) 选择适当的层析柱如果需要从复杂原料中将所有较大分子量的分子（如大于5000Da )的物质与小分子（5000Da以下）物质分开，可以选择排阻极限小的层析柱，如Sephadex G-25填料的柱子；如果要分离相对分子量相差不大的柱子，可根据各种凝胶的排阻范围进行选择。当然也可以购买填料自己装柱，但实验结果的重复性、稳定性不如预装柱。

(2）选择适当的缓冲液了解样品的稳定性，选择保证样品性质稳定的pH和离子强度的缓冲液。必要时，可以取少量样品进行测试。

多数情况下可用水作缓冲液，为了避免非特异性吸附或者对于一些在纯水中溶解度较低的蛋白质，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。对于一些吸附性强的物质也可采用水和有机溶剂的混合物进行洗脱。

(3）样品的处理样品在上样前一般要进行离心或过滤处理，以去除影响层析柱分离效果的杂质并可防止柱子阻塞。

少量样品一般在1000g离心15 min，细胞裂解液在4000-5000g离心30min，去除脂质和细胞碎片。

选择过滤的滤膜孔径与填料颗粒的孔径大小相关。对于与滤膜有非特异性结合的样品，应用离心代替过滤。

(4）上样量为了达到良好的分离效果，上样量必须保持较小的体积，一般为柱体积的2％-5%。

(5）洗脱与收集洗脱过程中应保持流速稳定，不宜过快。收集时应当根据样品的量和实验的目的选择适当的组分来收集。