疏水作用层析的工作原理是根据蛋白质分子表面疏水性的不同分离蛋白质。在适当基质上共价连接的疏水基团与蛋白质表面的疏水基团发生疏水作用，蛋白质被保留在柱上，蛋白质疏水性越强，结合越牢固。

利用促使疏水作用减弱的条件洗脱结合的蛋白质（如降低缓冲液离子强度，加入适当去污剂或加入乙醇或乙二醇等制剂降低缓冲液极性等）。疏水层析常在盐沉淀步骤或者离子交换层析之后进行（因为离子强度的增加能增强蛋白质分子表面的疏水作用）。

总之，蛋白质在组织和细胞中以复杂的混合物形式存在，每种细胞都含有成千上万种蛋白。蛋白质的分离纯化是一项极为复杂而艰巨的任务。迄今为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质都提纯出来。但是，针对任何一种蛋白都有可能选择一组合理的分离步骤来获取高纯度的制品。