(1) 没有明显的点：①样品量不够，增加样品量；②由于样品溶解的不充分，没有足够的样品进入IPG胶条，增加样品溶液中促溶成分的浓度；③样品中含有杂质，影响聚焦，增加聚焦时间或改变样品预处理方法；.PH梯度方向放置错误；⑤检测方法不够灵敏；⑥检测试剂不合格，检查染色溶液上标的日期是否过期，配制新鲜的染色溶液。

(2) 单个蛋白质产生很多个点或丢失、或在别的位置上：①蛋白质氨甲酰化，不要将含有尿素的溶液加热至30℃以上，否则尿素降解会产生异氰酸盐，使蛋白质氨甲酰化，改变它们的pl;②蛋白质氧化，在再水化液中和平衡液中加入DTT能使二硫键还原。为了更好地保护蛋白质，在进行二向分离前用碘乙酰胺处理，碘乙酰胺能使琉基烷基化，防止还原后的蛋白再氧化。

(3）点在垂直方向形成两点或“重点”：垂直凝胶IPG胶条放置不正确，确保IPG胶条支持膜贴着第二向凝胶玻璃板。

(4) 2-D图案扭曲：①垂直电泳第二向凝胶的顶部表面不平，灌胶后立即用水覆盖凝胶的表面；②（垂直凝胶）由于没有完全聚合、聚合速度过快或在灌胶时渗漏，从而使凝胶聚合不均匀，应从凝胶溶液中除气。通过增加50％的过硫酸铰和TEMED可以促进聚合反应，减少33％的过硫酸铰和TEMED能减慢聚合反应，确保在灌胶时无渗漏。

(5）水平条纹或不完全聚焦的点：①样品在加样前没有完全溶解，确保样品完全地的溶解。反复的沉淀一重溶循环能产生或增加水平条纹；②样品在再水化液中溶解很差，增加再水化液中促溶物质的浓度，增加IPG缓冲液的浓度；③干扰物质存在。非蛋白杂质在样品中能干扰等电聚焦，在最终的2-D结果中产生水平条纹，尤其是在位于凝胶酸性端一侧，改变样品制备方法以减少这些污染物；④在样品中有离子杂质。通过透析和稀释的方法将盐浓度下降到10mmoUL。用TCA、丙酮沉淀蛋白，然后重新溶解蛋白，也是一种有效的除盐方法，同时能除去脂类、核酸和其他小分子物质；⑤样品中存在离子去污剂。若用离子去污剂SDS处理样品，将样品稀释在再水化液后，离子去污剂的最终浓度不应超过0.25%。此外，为了确保完全除去与蛋白质结合的SDS，非离子去污剂的浓度必须是所有离子去污剂浓度的8倍；⑥加样过多。减少加样量；微量预备的分离需要纯净的样品。改进样品处理方法以减少污染物；开始设置很低的电压，然后逐渐增加电压。增加聚焦时间；⑦聚焦不完全，要达到完全聚焦的聚焦时间不够，应延长聚焦时间；⑧过聚焦，延长聚焦的时间（高于100 000 Vh)有可能导致电内渗和蛋白移动，从而产生水平拖尾。可减少聚焦时间。

(6）水平条带横贯凝胶：在琼脂糖覆盖层中或平衡液中含有杂质，准备新鲜的琼脂糖覆盖液和平衡液。

(7）明显的垂直条带位于样品加样点上（当用样品杯上样时）：样品蛋白间相互结合或蛋白沉淀，稀释样品，增加上样体积。电压在开始时设置很低，然后逐渐升高。

(8) 垂直拖尾：①平衡不充分，延长平衡时间；②电内渗，在SDS平衡液中加入30％的甘油及6mo1/L的尿素。在胶条的两端放置上样滤纸片，在第二向电泳过程中吸收多余的水分；③第二向缓冲溶液配制不正确，重新配制新鲜缓冲液；④在SDS电泳缓冲液中SDS不够，SDS使用浓度为0.1% (W/V)。

(9）在双向电泳图像中存在垂直的间隙：①样品中存在杂质，改进样品处理的方法；②再水化液的成分中存在杂质，使用高纯度试剂和去离子尿素溶液。③在第二向凝胶表面与IPG胶条之间存在气泡，确保在第二向凝胶表面与IPG胶条之间没有气泡。

(10）在垂直区域聚焦很差：IPG胶条没有完全水化，应确保有足够的再水化液来对IPG干胶条再水化。加入再水化液后，除去IPG胶条底部的所有较大的气泡。检查是否整个IPG胶条被再水化液覆盖。

(11) 高分子量的蛋白质少：①样品中的蛋白质水解，使用蛋白水解酶抑制剂或在抑制蛋白水解条件下对样品进行预处理；②平衡不充分，应延长平衡时间；③蛋白质从IPG胶条转移到第二向凝胶上效率低，在第二向电泳的样品进入凝胶时使用低电压；④在再水化过程中，样品进入IPG胶条的效果很差，使用建议体积的再水化液。

(12）点状条纹：多见于银染，用来灌胶的玻璃板很脏，或在凝胶表面上有颗粒物质。DTT和其他巯基还原剂会加剧这种效果。应正确清洗玻璃板。在将IPG胶条放置到第二向凝胶表面之前，用碘乙酰胺除去过多的或残留的巯基还原剂。

(13）在凝胶底部产生背景污渍：载体两性电解质被染色，用IPG缓冲液代替载体两性电解质。如果有必要，降低浓度。

(14）在凝胶顶部方向上产生背景污渍：多见于银染，样品中存在核酸。加入DNase和RNase来降解核酸。但是要注意的是DNA酶和RNA酶能在双向电泳图谱上出现。

（15）在凝胶上部区域出现高背景：在SDS电泳缓冲液中，存在蛋白污染或电泳仪不干净。重新配制SDS电泳缓冲液。将电泳仪清洗干净。
应现配现用或以一定单位量在-20℃条件下储藏。若需要的话，尿素的浓度可以增至9或9. 8mol/L。其他的去污剂（Triton X-100、NP -40和其他非离子或兼性去污剂）能代替CHAPS。若需要的话，可加入蛋白质水解酶抑制剂。

在使用前加入DTT和IPG缓冲液或Pharmalyte：每2. 5m1的再水化储存液中加入7 mgDTT。若通过再水化液进行加样，在使用前，将样品加入到再水化液中。若需要的话，尿素的含量可以增加至9或9. 8mol/L。 2. 5m1分装，-20℃储存。

在使用前加DTT：每．2. 5m1的再水化储存液中加入7 mgDTT。若通过再水化液进行加样，在使用前，将样品加入再水化液中。125μl IPG缓冲液用于0.5％浓度，500μl IPG缓冲液用于2％浓度。2. 5m1分装，-20℃储存。

将所有成分加入到500m1的烧瓶中。轻轻地摇晃，使成分混匀。在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解。不要让溶液暴沸。以2m1为单位分装，室温保存。
如需要，第一步的固定过程可延长至3天。在敏化液中不加戊二醛，银染液中不加甲醛，以及省略保存步骤，则此方法适用于质谱分析，尽管灵敏度有所降低，如果要加戊二醛和甲醛，请在染色前加入。甲醛的用量在100-250μl之间，依赖于蛋白量和蛋白点的数目，因为甲醛是在显色过程中被蛋白消耗。甲醛在临用前加入。显色过程中，当蛋白点达到满意的染色深度时，需要把凝胶转移到终止液中，以免背景变深。软件分析理论上，在一块胶上应当能分离出多达15 000种蛋白。然而实际能检测到5000个蛋白点，就意味着分离效果相当不错。通过对两块凝胶进行简单地对比来评估高分辨率的第二向凝胶往往是不可能的。在具有几千个样点的图案研究中，通过感观检测出新出现的一些点或单个点的消失几乎是不可能的。图像采集硬件及图片分析软件能检测到这些差异，并且能从凝胶图案上获得最大限度的信息。许多公司已经开发出了用于双向电泳的分析软件。

双向电泳技术往往是用来进行比较，因此需要一种重复性好的方法来确定相关点的位置。因为预制IPG干胶条具有很好的重复性，蛋白的pH可以在线性pH度IPG胶条上的聚焦点位置来估计。使用加样到第二向凝胶边上的分子量标记蛋白，可以对第二向的结果进行校准。往往样品中一些高丰度蛋白质的PI和分子量是已知的，这些蛋白质能当作内参标准。应该注意的是，蛋白质的PI依赖于周围的化学环境，因此实验条件的不同，PI可能发生改变。尽管可用标记蛋白来进行PI估计，但这种估计方法也并非准确。