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PCR产物分析

发布时间:2015-09-18 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1003

PCR产物分析对标本的纯度要求低,不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

1) 凝胶电泳分析:PCR产物电泳,EB(溴乙啶)染色,紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片段都应符合预计的大小,这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳:通常应用1%-2%的琼脂糖凝胶,供检测用;聚丙烯酰胺凝胶电泳:6%-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析。

2) 酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。

3)分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。Southern印迹杂交:在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研;斑点杂交:将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

4)核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

PCR产物电泳:将1-10μl PCR产物,与适量的上样缓冲液充分混匀后进行电泳。一般电流为l0mA、电压100V,电泳30min。电泳结束后,在紫外灯下观察,满意的结果可进行扫描打印。

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