(1)为标记代谢悬浮细胞，应400g离心5分钟。洗细胞时，使用预热的PBS，离心如前所述。用预热培养基（含10％透析血清，不含L-蛋氨酸和L-蛋氨酸）重悬细胞，并使密度大约为1 ×107个细胞／ml。 37℃孵育1h。加入浓度为l0mci/ml的标记35S-蛋白混合物，37℃孵育30min至lh，并不时混匀。离心收集细胞，并用预冷培养基（含3mmol/L L-蛋氨酸和1 mmol/L L-蛋氨酸）重悬。

(2)35S标记率取决于单个细胞生长速率。HeLa细胞生长较快，当密度大约为60％时就能有效标记。对于生长较慢的细胞，当密度为75％-85％时才能标记。

(3）如果蛋白质带有一些放射性反应前体的氨基酸残基或半衰期比较长，则不能有效地标记。使用含放射性蛋氨酸和半胧氨酸表达35S-蛋白标记混合物与单独35S-蛋氨酸相比较能增加目的蛋白标记量。如果蛋白质的半衰期比较长，应该适当增加标记时间。若上述方法失败，建议使用环己酞亚胺阻滞方法检测蛋白半衰期。

(4）蛋白酶，钙蛋白酶，或溶酶体抑制剂在平行试验中追加到培养基中，检测蛋白降解和特殊的蛋白分解机制是否有关。通常使用的蛋白酶抑制剂包括：Lactacystine（12. 5 μmol/L )，MG132 (50μmol/L）和LLnL (50μmol/L)。 Lactacystine能有效抑制26S蛋白酶活性，MG132和LLnL能有效消除钙蛋白酶和蛋白酶活性。在文献中使用的其他抑制剂包括：抑制钙蛋白酶降解的总钙蛋白酶抑制剂（30-60μmol/L）或钙蛋白酶抑制剂II (5 μmol/L )，在溶酶体中发现的半胱氨酸蛋白酶E64 (50μmol/L) (4）。注意，很多蛋白酶抑制剂能抑制多种蛋白酶活性。使用蛋白酶抑制剂研究蛋白质半衰期的结果，仅能作为确定蛋白质细胞降解通路的参考。

(5）用0. 5m1预冷PBS刮细胞，样品转移到离心管中，4℃14 000rpm离心1分钟。移弃上清，并将细胞沉淀放液氮保存。待所有时间点样品收集完毕，然后裂解细胞准备提取。

(6）如果背景较高，则在变性条件下裂解细胞，用免疫印迹检测。用350μ1预热的1 % SDS裂解缓冲液（50 mmol/L Tris·HCl, pH7. 5 ;0.5 mmol/L EDTA; 1% SDS; 1mmol/L DTT)。如果样品较粘，说明样品含高分子量DNA，应超声破碎DNA，煮10分钟，然后用含0.5%NP-40 lysis buffer 1：10稀释（50 mmoUL Tris, pH 7.5; 150 mmol/LNaCl; 0.5% NP-40；50mmo1/L NaF; lmmol/L DTT; lmmol/L NaV03和蛋白酶抑制剂），再进行免疫印迹。

(7) 抗体和细胞提取物的量视具体情况而定。如500μg总蛋白提取物，2-3μl天然抗血清或2.5 -5μg纯化吸附抗体是合适比例，但是最好用滴定法测量样品随抗体增加，用来检测目标蛋白的量。

(8)在G1期使用a-因子（3μg/ml)，在S期使用经基脉(10mg/ml)，或在M期使用15 μg/ml细胞有丝分裂抑制剂，能使酵母细胞处在同步细胞周期。在细胞周期的不同阶段，检测目的蛋白的半衰期。

(9）为检测酵母蛋白的降解是否依赖于特定的蛋白酶，温度敏感的酵母突变株，可用来检测半衰期。将结果与在许可温度条件下检测蛋白的半衰期相比较。温度敏感的突变酵母株在敏感温度下进入对数期(OD600:0.4-0.6)，然后改为不敏感温度1-2h。上述脉冲示踪和启动子关闭实验都是在不敏感温度条件下进行的。

(10）为检测酵母细胞是否在机械力的作用下完全溶解，取出几微升裂解液涂在载玻片上，在光学显微镜下观察。如果大量的酵母细胞仍然是完整的，要加大涡旋的力度。

(11) 从不稳定mRNA翻译来的蛋白（例如Cln3，半衰期T1/2大约为3. 5min) ,葡萄糖的条件足以抑制目的蛋白的生理合成。对稳定mRNA合成的蛋白质，将1 mg/ml环己酰亚胺追加到含有葡萄糖的培养基中，可抑制其转录和翻译。