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蛋白质甲基化研究注意事项

发布时间:2015-09-22 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:811

(1) GST融合蛋白要比其他融合蛋白好,应用时的体积由蛋白提取及纯化的效率,依经验而定。

(2)大多数GST-PRMTs经过-70℃的冻融后都会失去活性,其中的例外就是PRMT4/CARM1,它可以加入10%甘油在-70℃冻存,而不影响其活性。其他重组的转甲基酶蛋白都可保存在4℃,两天内使用。

(3)另外,用X线间接摄影法来探测氖信号时,可以把胶浸泡在加强液里,然后真空晾干,再把胶放在-70℃保存。我们发现,把蛋白转印到PVDF膜上,然后把膜用EN 3 HANCE孵育3次,可以明显增强信号。这种方法还可以在分析结果之后用Western blotting定量,确保上样一致。用PVDF膜做Western blotting时,用100%甲醇洗2次、TBST洗2次(0.1%的Tween-20),把加强液洗掉。洗过的膜用脱脂奶粉封闭,然后做Western blotting。

(4)蛋白合成抑制剂的活性非常重要。如果蛋白合成没有完全抑制,氖标记的甲硫氨酸就会与新合成的蛋白结合,导致实验失败。为了确定蛋白合成抑制剂的活性,一个10cm培养皿的HeLa细胞用细胞培养液A孵育30min,再加5ml含有50μCiL- [35S]-甲硫氨酸的细胞培养液B,孵育3h。再设计一个不加蛋白合成抑制剂的对照。收细胞后,做成样品进行SDS一PAGE,在X线胶片上放置过夜。

(5)体内没有去甲基作用来干扰PRMTs和具有SET结构域的赖氨酸的去甲基酶的活性,因此,N-精氨酸和N-赖氨酸天然的甲基化反应与本实验应有所不同。

(6) 20 ELmol/L的AdOx可以在PC12和RATI细胞中有效的防止甲基化反应的发生。而微量的AdOx即具有细胞毒性,用AdOx处理的细胞会停止生长,失去细胞活性。

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