准备

（1)培养基

可用于培养藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同。本方法建议淡水藻类可用表5-3-1中推荐的培养基。经空气平衡后，培养基的pH接近于8。亦可使用其他培养基，但对必要成分限制如下：

P≤0.7mg/L;N≤10mg/L;鳌合剂≤10-3mmoL/L；硬度（Ca+Mg)≤0.6mmol/L。

配制好的营养盐类贮备液经0.2Nm滤膜过滤或高压灭菌（120℃,15min）后4℃避光冷藏保存。贮备液4只能用滤膜过滤灭菌。

(2）培养基的配制

配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌的蒸馏水或去离子水中。应按顺序逐一加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。为了方便和节省时间，亦可先分别配制各种营养盐类的浓贮备液（如浓缩1000倍），经过滤或灭菌后避光冷藏保存。当需要配制培养基时，将一定量的浓贮备液依次摇匀加入到蒸馏水或去离子水中即可。
当保存藻种需要使用固体培养基时，可在灭菌前加入1.5%-2.0%（重量／体积比）的琼脂到培养基中。

(3）贮备培养

得到纯藻种后，需要加以保存，以备试验时用。

藻种可在试管内固体培养基斜面上保存。在培养基中加入1.5%^'2％的琼脂，灭菌后倒入试管，冷却成斜面，然后接种藻类，棉塞封闭，在较低的光照和温度条件下可保存较长时间。大约每隔1个月至2个月转接一次。

如果经常进行试验，贮备培养物应在液体培养基中保存。在三角瓶中加入约l00ml培养基，接种藻类，在试验要求的相同温度和光照条件下培养，7-10d转接一次，以保持培养物生长良好，随时有足够的数量可用于试验。

应该经常检查贮备培养中藻类的生长情况，包括形态和生长速度，以及有无菌类和其他藻类的污染。

一般当藻类进入停滞生长期时应转接。培养物有畸形生长或受到其他藻类或菌类的污染时应废弃或采取纯化、复壮等措施。

(4）预培养

自贮备培养物中取出一定量的藻液，接种到新鲜的无菌培养基中，接种藻细胞浓度大约为104个/ml（±25%)。在试验要求和相同条件下培养。应使藻类在2-3d内达到对数生长，然后再次转接到新鲜培养基中。如此反复转接培养2-3次，经检查藻类生长健壮并正处于对数生长期时即可用来制备试验中需要的藻试验液。
每次试验中的藻试验液必须来自同一个贮备培养物。己经在以前的毒性试验中使用过的藻培养物不得再次使用。

(5）设定平行和对照

正式试验中每个测试浓度至少要设置三个平行样，每一系列设两个对照样。也可根据需要增加浓度或减少平行样的数量。
当使用助溶剂增加受试物的溶解度时，对照组中助溶剂应与测试液中助溶剂浓度最高时一致。

试验操作

(1)预试验（确定浓度范围试验）

为确定正式试验中受试物的浓度范围，可以先进行一次预试验。

预试验的浓度可按对数间距排布，最低浓度应为受试物的检测下限，最高浓度应为饱和浓度。无需设平行样。测定项目和方法可简化，试验时间也可缩短。
如果预试验中在最高浓度测点，藻的生长抑制低于50%，或者在最低浓度测点中藻的生长抑制高于50%，可不必再进行正式试验。

如果有必要进行正式试验，可根据预试验的结果确定正式试验时受试物的浓度范围和浓度间距。

(2)易溶于水的化学物质的正式试验

①受试物试验液：用经0.45μm滤膜过滤后的培养基配制受试化学品的贮备液，其浓度为测试时所需最高浓度的二倍。

用此贮备液稀释配制成一系列不同浓度的受试物试验液，其浓度也分别为测试时所需浓度的二倍。试验浓度可按10,n/10或n√10的几何级数或等对数间距设计。
试验前应测定受试验液的pH值，必要时用HCl或NaOH液将pH调整为7.5±0.2。

试验结束时应测定受试物浓度。

②藻试验液：藻试验液是用于进行试验的藻培养物，对藻类进行预培养后，镜检其生长情况，并计数细胞浓度。然后用培养基稀释至藻细胞浓度为2×104个/ml，即成为可用于试验接种的藻试验液。

③测试液：测试液是正式用于测试的，含有藻试验液和受试物试验液的液体。

先在每个三角瓶（或其他培养容器）中加入50ml藻试验液，然后再添加50m1受试物试验液。

对照组瓶中不加受试物试验液而只添加50ml培养基。将各瓶摇动均匀后放入培养装置，试验正式开始。

④藻类生长状况的测定：试验开始后，每隔24h，即在24、48、72h时，从每个瓶中取样进行生长测定。测定项目包括藻类细胞浓度、光密度或叶绿素。最好同时测定前两项，如果工作量过大，也可只测定细胞浓度。当使用颗粒计数仪或分光光度仪进行测定时，过滤的培养基分别作为背景和空白。试验开始和试验72h后，应测定pH值。试验期间溶液pH偏差大于1个单位是不正常的。

(3）有限水溶性化学物质的正式试验

如果受试物的水溶性低于1000mg/L，试验操作应作如下修改：

①受试物试验液：用适当的溶剂制备受试物的贮备液，其浓度应是测试时所需最高浓度的104倍。溶剂应对藻类生长无影响，并且在试验溶液中的含量最高不得超过100mg/L。

要设置助溶剂对照，其浓度应与试验液中助溶剂的最高浓度一致。

②藻试验液：用培养基将经过预培养的藻培养物配制藻试验液，使细胞浓度为104个/ml。

③测试液：每个三角瓶中加入loomi藻种液，再添加10μl溶剂。其他步骤同易水溶性化学品。

(4)挥发性化学物质的正式试验

目前，还没有被普遍接受的方法来测试挥发性物质。当已知一种物质有挥发倾向时，应使用密封的磨口烧瓶测试。应设法测定溶液中受试物的量，最后应说明易挥发性化学品的测试结果是在密闭系统中进行的。

(5)废水或环境水样的正式试验

当受试物为废水或环境水样时，水样必须密封、低温存放0-4℃。样品瓶中应充满水样不留空气，尽量使样品毒性变化较小，而且在试验前的保存时间越短越好。测试废水样品或环境水样之前要预先振摇。可直接用水样作为毒物试验液；如果水样毒性过大，也可使用稀释水配成适当浓度的试验液，对于含有难溶性毒物的水样，同样可以使用助溶剂或乳化剂。

如果水样所含毒物在一段时间内不稳定，必须定期分析。

废水的稀释液浓度可用体积百分比表示。

(6)藻类生长测定方法

测定藻类生长的指标和方法很多，本方法推荐采用以下测定方法：

①细胞计数：在显微镜下，用O.lml计数框或血球数板对藻细胞的数量计数。用计数框时可采用视野法，即对显微镜视野中的所有细胞计数。放大倍数40×10。每片至少计数10个视野，如果藻细胞密度小，则要适当增加计数视野。藻数按视野累加。每次计数（同一批取样的样品）应采用相同方法（视野数目、放大倍数等）。
每一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15％，应予重新计数。如工作量过大，可先取样，用鲁哥氏液固定后保存，留待以后计数。镜检计数工作量较大，有条件时可采用电子颗粒计数仪。

②光密度：取一定量的测试液在分光光度计上测定其光密度，波长可选用650、663nm
或其他波长，亦可用荧光光度计测定。

③叶绿素：样品经离心或过滤后，用丙酮、乙醇或其他溶剂萃取，进行分光测定，亦可用荧光光度计测定。