本方法提供的是淡水型发光菌，它无需3％的NaCl即可正常生长和发光，故而对于一般水体或污染物的检测有其自身的优点。对一般化学品，可配制恰当浓度的水溶液进行检测。

该淡水发光细菌在干净水体中发光恒定，当受到污染毒物影响时，发光受到抑制，受抑制的程度与水体中毒物的总体浓度相关，故可以用生物与化学发光光度计测定其发光强度，评估该水样的毒性。而毒性大小可按本方法规定的方式表征为参比物苯酚的浓度(mg/L)，或EC50值（能产生抑光率为50％的受测样品的百分浓度。对化学品而言，则为mg/L）。

1．水样的采集与保存

水样采集用预先洗净干燥的500ml广口瓶，一般距水面10-15cm处取样，并装满水瓶，立即用胶带封口。记录水样名称、地点、时间等项目。应在采集后6h内进行毒性测定。如需保存，样品应置于4℃冰箱内，最多不超过12h。结果报告中应说明采集时间和测定时间。从采集到测定不得超过12h。

2．样品处理

(1)水样的预处理

若样品含有不溶性悬浮物，必须静置后取上清液。有色样品必须稀释至基本无色或使颜色尽量减淡才可用于测试。测试前每l00ml样品加入l0g乳糖，使其完全溶解。

(2)化学品的预处理

化学品需配制成水溶液。测试前加入乳糖使其浓度达10%。

(3）固体废物或污泥样品的预处理

按固体废物：水＝1：5的比例，加入三角烧瓶中，在摇床上振摇8-10h，静置10-14h,取上层清液，按（1)的水样方式进行。污泥应尽可能去除水分再称重，否则需先测定其含水率，然后扣除水分后按固体废物的处理方式进行。

3．仪器设备

①生物化学发光光度计：原则上一般市售的化学发光光度计均可应用。

②微量加液器：20μ1,40μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl。

③移液管：1m1,2m1,5ml,10m1。

④容量瓶：50ml,100ml，1000m1。

⑤旋涡混合器。

⑥摇床。

4．菌种和试剂

(1）菌种

青海弧菌Q67(VibtzoqinghaiensisQ67）冻干粉剂。封存于安瓿中，每安瓿管0.5g,有效保存期6个月（-18℃或更低）。当按本方法之规定将冻干粉复苏后5min即可恢复发光，在暗室中肉眼应可见其发出的幽幽绿光。经适当稀释后，可用于检测。

(2）试剂

氯化钠（NaCl)，化学纯。乳糖，分析纯。

①0.8%氯化钠溶液：氯化钠8g溶于1000mg/L蒸馏水中。保存于4℃，一周内可用。

②10％乳糖溶液：乳糖100g溶于1000ml蒸馏水中，当天配制使用。

(3）参比物

苯酚，分析纯。

①苯酚母液1000mg/L：用分析天平快速称取100mg苯酚晶体，立即放入事先放好30-50ml的10％乳糖溶液的100m1烧杯中，使溶解，然后倒入100m1容量瓶中，用10％乳糖溶液定容，置4℃冰箱保存备用，保存期2d。

②苯酚标准溶液20，40,80,100,120,160,200,250,300mg/L：用上述l000mg/L的苯酚母液以移液管按表5-3-9吸取苯酚液分别放入50ml的容量瓶中，然后以10％乳糖溶液定容。配制完后应立即进行发光测定。

5．试验程序

(1)发光测定的环境条件

室温，18-30℃均可进行，但测试过程中要求温度波动在±1℃内。

(2)测定步骤

1)淡水发光菌冻干粉的菌体复苏：将冻干粉安瓶及复苏液（0.8％的氯化钠）先置于4℃冰箱内约10-15min，然后将该复苏液lml注入安瓶内，置于旋涡混合器上使之充分混匀、溶化，数分钟后在暗室中肉眼应见绿色荧光。若无绿色荧光，则不能使用。将该菌液倾倒于一干净试管内，再以lml复苏液注入安瓶，振荡后再倾入试管内，再次在旋涡混合器上充分振荡混匀。一般每安瓶可加复苏液5-6m1，肉眼检视应为乳白色均匀液体，静置后无沉淀即可应用。

2）样品抑光程度的检测：

①样品稀释准备；将水样按下列浓度稀释：100%,50%，以10％乳糖溶液作稀释液，每个浓度设三个平行样，以10％乳糖溶液作为空白对照，也设三个平行样。分别加入测量杯中，每个加量lml或2m1。

②发光菌液的加入：根据仪器测试每个样品的时间，计算好每个样品间隔时间。例如，若仪器测试1个样品需l0s，则按间隔20s或30s一个样品，逐个添加50μl或100μl菌液，以确保检测所得为每个样品与发光菌作用了相同的时间。一般可用15min的作用时间。

③检测估算：上述样品所得发光值，每三个平行样取平均值，然后按7(1)数据处理的规定，计算相对发光强度。如果水样原液（即100%）的相对发光强度＞50%，则因为无法测得其EC50值，结果只能用相应的该相对发光强度之对应苯酚浓度来表示毒性大小。如果水样相对发光强度＜50%，可按下述3)继续进行，测定其EC50。

3)样品的EC50值的检测：

①样品稀释：按检测结果设定3-4个稀释度，最高和最低稀释度应包含预测所得之稀释浓度。例如预测得到样品稀释度在50％时相对发光强度＜50%，则可设75%,50%，25％和10％等四个浓度。每个浓度仍应设三个平行样。同时设空白对照的三个平行样。

②发光检测：按设定间隔时间，应精确到秒，分别加入50-100μl菌液，15min时检测发光值。按顺序逐一获得数据。

4）参比物苯酚溶液的标准曲线的制作；在每次检测样品时，均应用相同的安瓿内的菌液同时制作苯酚标准曲线（如果样品较多，可以用几支安瓶打开后混合使用）。标准曲线的浓度系列按上述4(3)②制备。其加入发光菌液的操作方式与样品检测相同。

6．质量保证与质量控制

(1)方法的精密度

样品二次测定的结果其相对误差≤15％。重复测定时应采用第一次测定时使用的发光菌液。即二次测定应采用相同的菌液。

(2）苯酚标准曲线的准确度

按一元一次线性回归方程进行计算，其抑光率（I)与苯酚浓度（C）之间应符合下列关系：

I=a+bC

回归方程应符合统计学检查要求（p<0.90),EC₅₀值应在100-200mg/L之间。

7．数据与报告

（1)数据处理

相对发光强度（L）和抑光率（I)的计算：

L(%)＝样品发光强度/对照发光强度×100%

I(%)=对照发光强度一样品发光强度/对照发光强度×100%

(2)EC₅₀值

EC₅₀是指受试物对发光菌作用后，发光强度下降为对照组的50％时（即相对发光强度为50％或抑光率达到50％时）之受试物浓度。当受试物为水样时，以稀释度（百分浓度）为单位；当受试物为化学品时，以mg/L为单位。EC50值越小，表明受试物的毒性越大。例如对于水样，A样品的EC₅₀=76.5%，表示该样品的稀释度为76.5％时抑光率是50%,B样品的EC50=26.5%，表示B样品的稀释度为26.5％时的抑光率是50%。A样品与B样品相比，显然B样品要比A样品的毒性大，因为达到相同的抑（50%）时，B样品的浓度更低。

对于化学品，假如A样品的EC₅₀=0.lmg/L,B样品的EC₅₀=10mg/L，显然A样品的毒性大于B样品，因为同样抑制发光菌50％的发光，A样品的浓度更小。

(3）样品毒性表达

①用苯酚浓度表示：当未经稀释的样品（即样品稀释度为100%）的抑光率在5%-95%时，也即相对发光强度在95%-5％范围内，可以用相同抑光率时苯酚的浓度来表示样品的毒性。大多数水样均在此范围内。

②用EC₅₀值表示：对水样而言，在样品毒性甚大时，即100％浓度的样品其抑光率大于95％乃至使细菌发光完全碎灭时，必须将样品稀释若干倍之后才能进行检测，然后用抑制50％的发光量时该样品的稀释百分浓度来表示样品的毒性。显然稀释百分度越小，毒性越大。一般实测结果不能直接获得EC50值时，可将所测的样品系列浓度（％）与对应的抑光率作图，再通过图上查对50％抑光率所对应的样品百分浓度，即可求得EC₅₀值。

对化学品，EC₅₀值用mg/L的浓度值来表示。显然，EC₅₀值越小，毒性越大。

③毒性表达方式还应注明样品与发光细菌作用的时间，因为作用时间也影响数值大小。如作用15min就与作用20min的数值不同，故还必须表明作用的时间。一般可在数值表达后用括号加注作用时间，例：EC₅₀=0.10%(15min)，或抑光率45%(15min)，表明是作用15min时实测数据。本方法建议采用15min的作用时间。

(4)测定报告内容

①实验室温度（℃）。

②采样地点。日期、时间。

③测试日期、时间。

④样品的EC₅₀值，或100％浓度的样品的抑光率及其对应的苯酚浓度，注明作用时间(min)。