一、高效液相色谱仪的使用注意事项

(1)更换流动相时，若欲更换的流动相与前一种流动相混溶，可打开排液阀，用欲更换的流动相以l0mL/min的流量工作5-10min，预置排出先前的流动相，然后关闭排液阀，以1.0mL/min流量清洗色谱柱，再接上柱后检测器，清洗整个流路；若新的流动相与原流动相不相溶，则要用一个与两种流动相都混溶的流动相进行过渡清洗。

(2)高压泵应避免长时间在高压下工作。如果发现泵的工作压力过高，流量减小，可能由以下原因造成：色谱柱、保护柱、管路、检测池或检测器的入口管部分堵塞、过滤器和柱子上端接头等堵塞或输液流量太大，此时应立即停止泵的工作，待查清故障原因再开泵继续进行工作。

(3)实验开始前和实验结束后，用纯甲醇冲洗管路和色谱柱若干时间，可以避免许多意想不到的麻烦。

(4）泵与进样阀的连接用不锈钢管（配连接螺钉和密封刃环）连接恒流泵液体出口与进样阀入口（为了保证样品较少扩散，进样阀与色谱柱之间以及色谱柱与检测器之间的连接管应尽量要短）。

新购买的管路需经过清洗后才能使用，清洗顺序为：氯仿→甲醇（或无水乙醇）→水→lmol/L硝酸→水→甲醇→氮气流吹干；聚三氟乙烯管使用前用甲醇冲洗即可。

(5)溶剂过滤装置所有溶剂在使用之前必须经过严格过滤，除去微小的机械杂质，以防这些微量杂质磨损泵的活塞、堵塞柱头垫片、阻塞进样阀或输液管道。除去机械杂质最简单的办法是使用真空泵的微膜过滤除去杂质。

(6)溶剂脱气装置流动相进入高压泵之前必须进行脱气处理，否则流动相通过色谱柱时气泡受到高压而压缩，流至检测器时因压力降低而将气泡释放，增加基线噪声，严重时会造成分析灵敏度下降、基线不稳，使仪器不能正常工作，在梯度洗脱时这种情况尤其突出。常用的脱气方法有超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气以及在线（真空）脱气三种。

二、高效液相色谱柱系统的日常维护

(1)在进样阀后加流路过滤器（(0.5μm烧结不锈钢片），挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒。

(2)在流路过滤器和分析柱之间加上“保护柱”，“保护柱”装填有与分析柱相同的固定相，柱长一般为5-30mm，收集阻塞柱进口的来自样品的降低柱效的化学“垃圾”；保护柱是易耗品，实验室应有备用保护柱，以便经常方便地进行更换。

(3)样品量不应过大，流动相流速也不应一次改变过大，色谱柱应避免突然变化的高压冲击。

(4)色谱柱应在要求的pH范围和柱温范围下使用，应使用不损坏柱的流动相，以免进样后对色谱柱造成损伤。

(5)每次工作结束后，都应用流动相出冲洗色谱柱10-20min，并继续用强溶剂（乙腈或甲醇）冲洗色谱柱。

三、高效液相色谱柱的制备技术

1．色谱柱的制备

色谱柱的材料通常用不锈钢，内壁要抛光才能使用。当柱压不超过7MPa时，也可用厚壁玻璃或石英管柱。柱子使用前要依次用氯仿、甲醇、水清洗，再用50％硝酸对内壁作钝化处理l0min以上，使内壁生成钝化的氧化物膜层。如果实验室具备一定条件的话可以自行填充液相色谱柱，填充液相色谱柱的方法主要有干法和匀浆填充法两种。

(1)干法原则上微粒大于20μm的填料可以用这个方法填充液相色谱柱。具体方法为：将填料通过一端漏斗分多次加入到垂直放置的柱管中，另一端装上筛板，同时要边填充边敲打或振动柱管，直至填满为止。除去漏斗，再轻敲柱子数分钟，至确认已装满，然后装上筛板，接上高压泵，在高于使用的柱压下，用载液冲洗数小时，以逐去空气，得到填充紧密而均匀的色谱柱。

(2)匀浆填充法匀浆填充法装柱又称湿法装柱，无论大粒径还是小粒径固定相均可采用此法装柱，但直径小于l0μm的填料，不能用干法填充，必须采用湿法。具体方法是：用二氧六环和三氯化碳，或三氯乙烯和三溴乙烷等溶剂，按固定相的密度不同，采用不同的溶剂比例，配制成密度与固定相相近的溶液，经超声处理使填料颗粒在此溶液中高度分散，呈现乳浊液状态，成为无明显结块的半透明匀浆，脱气后装入匀浆罐中。然后用加压介质（己烷或甲醇等）在高压下将匀浆压入柱管中，便制成具有均匀、紧密填充床的高效液相色谱柱。

匀浆填充法的关键是匀浆的制备，并需要一台性能优良的大流量泵。

2．梯度洗脱技术

当用组成一定的流动相达不到分离要求时，可按一定程序不断改变流动相组成，使组分得到较好的分离，即采用梯度洗脱。梯度洗脱技术可以改进复杂样品的分离，改善峰形，减少脱尾并缩短分析时间，提高分离效能，而且还能降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段，因为这些样品的k/范围宽，不能用等度方法简单地处置。

有些样品用等度洗脱可能分离得也很好，但色谱柱中可能滞留有少量强保留组分，使柱子逐步失活，而且还可能干扰到下一个样品的分析。这种情况也可以采用梯度洗脱技术来解决。

梯度洗脱分低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）两种方式。

(1)低压梯度常压下将两种溶剂在在混合器中混合均匀，再用泵加压输入色谱柱。其优点是只需一个高压输液泵，价廉，使用方便。

(2)高压梯度是先用两台高压输液泵将极性强度不同的两种溶剂打入混合室进行混合，然后以一定的流量输出进入色谱柱。两种溶剂进入混合室的比例可由程序控制器或计算机来调节，两输液泵的流量可独立控制，可获得任意梯度的程序，精度高，易于实现自动化控制。但至少需要两台高压输液泵，仪器价格昂贵。

虽然梯度洗脱技术比等度洗脱复杂，实用方法的建立比较困难，而且梯度洗脱时基线常常飘移不定，但是随着近期设备、材料的进展以及对这种技术更好的理解，上述问题基本上已被克服，因此，梯度洗脱技术仍然是液相色谱实验室常用的重要技术之一。

梯度洗脱，流动相组成不断发生变化，不宜使用折光检测器。

四、薄层色谱法操作技术

1．仪器与材料

(1)玻板用5cm×20cm或10cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

(2）固定相常用固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。其颗粒大小，一般要求直径为10-40μm。按各品种项下规定取一定量的固定相，按“薄层板制备”方法制备薄层板。

(3)薄层涂布一般可分无黏合剂和含黏合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的黏合剂，一般常用10%-15%锻石膏（CaSO4•2H2O在140℃加热4h)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5%-0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

(4)展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，便于观察。

2．操作方法

(1）薄层板制备根据各品种项下规定，取1份固定相和3份水（或黏合剂）在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，用倾注法或平铺法或涂布器法，在玻板上涂布成厚度为0.2-0.3mm的薄层板，将涂好薄层的玻板置水平台上，于室温下晾干后在110℃烘30min，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

(2)点样用微量注射器或微量吸管吸取规定量样品溶液，点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为2-4mm，点间距离为1.5-2.0cm，点样时必须注意勿损伤薄层表面。

(3)展开展开缸如需预先用展开剂饱和，可在缸中加入足够量的展开剂，并在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封缸顶的盖，使系统平衡。将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5-1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）。密封缸盖，待展开至规定距离（一般为0-15cm）取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。