一、死细胞与活细胞的显微判别

（一）健康细胞与衰老死亡细胞的观察

健康细胞即是所谓的活细胞。在显微镜视场下，健康细胞的形态表现为细胞匀质明亮，透明度大，折光性强。相差显微镜的视场下，可以看清细胞的形态结构，细胞质中有粗大的线粒体颗粒和细胞核。

细胞培养术语中，死细胞一般指衰老细胞和死亡细胞的总称。

另外，相对于正常细胞大小两倍以上或1/2以下的细胞分别称作“大细胞”或“小细胞”。“大细胞”可以理解为多个细胞融合形成的临时细胞，或细胞经历核分裂但未能完成细胞质分裂的那些细胞，这些细胞不能正常分裂，故属于死细胞。“小细胞”一般是由于培养环境或培养液含有细胞凋亡因素，由细胞凋亡形成的规则小膜泡。

1．微量移液器的结构及其使用

通常需要使用微量移液器的辅助才能将细胞培养物的单细胞悬液准备好，以便在显微镜下观察细胞的形态特征。

对微量移液器的结构了解是非常必要的（图9-5)。使用时，微量移液器的操作手势和取吸嘴动作要领也有一定的规范，具体参考指导教师的现场示范动作。使用时，所取液体不可接触移液器吸嘴连接部。

移液器调节刻度至最大量程以免影响移液器的精密度，存放时应立放于指定位置。

2．台盼蓝染色法

用微量移液器定量移取单细胞悬液，另取0.4％台盼蓝染液与细胞悬液按1：1比例混匀。然后滴加到干净的载玻片上，加盖玻片使成单层细胞悬液。
染色3-5min后，在l00×显微视场下观察。死细胞和细胞碎片均被染成蓝色，活细胞则不着色。

此种方法应用比较广泛，技术难度相对较小。

但需注意，有些异常大小的、不着色的细胞不一定是活细胞，如“大细胞”和“小细胞”。

3．显微形态直接判别

用微量移液器定量移取单细胞悬液，滴加到干净的载玻片上，加盖玻片使成单层细胞悬液。这种方法判别死活细胞有一定的技术难度，需要经过训练才能逐步把握。

(1)连续变焦细胞形态观察在100×-400×显微视场下往复变焦观察。死细胞和细胞碎片的轮廓欠圆润，甚至不连续，细胞或碎片持续发亮的行程比较短。活细胞则相反，细胞轮廓圆润有清晰界限，随着往复变焦调节，能观察到持续发亮的细胞，即发亮行程比较长。

(2）非变焦细胞形态观察在100×-400×显微视场下，调焦观察目标细胞。

在悬浮细胞培养物中，死的细胞和细胞碎片的轮廓欠圆润，甚至不连续。活细胞轮廓圆润有清晰界限，大小均匀。

在贴壁细胞培养物中，活细胞的贴壁生长形态富有特征，有特定的克隆生长形态。死细胞的原有贴壁生长形态完全丧失或部分丧失，如呈悬浮状态的、边界不圆润的或细胞膜不完整的细胞。

4．根据细胞是否增殖进行判断

此种判断非常准确，但需要连续多天观察。观察到细胞形成克隆样生长，细胞数量增加的属于活细胞，否则为死细胞。

二、动物活细胞计数技术

（一）计数板准备

先用酒精棉球分别擦拭血细胞计数板的2个计数窗及其专用盖玻片，再用干净纱布擦拭干血细胞计数板的2个计数窗及其专用盖玻片的残余酒精和水分。小心装载盖玻片使悬空放置到计数板窗口上。

（二）血细胞计数板的读数窗结构和读数方法

血细胞计数板读数窗结构中，设计有2个读数窗，也称计数窗，周边有沟槽，有两道与读数窗平面高出0.lmm的横梁，承载盖玻片用（图9-6)。
配套的盖玻片规格要求24mm×24mm，厚0.13-0.17mm。

盖玻片放于计数板上，与读数窗的斜面形成“V”形夹缝。

细胞悬液加载于读数窗的斜面上，沿“V”形夹缝进入读数窗平面与盖玻片形成的空间。

图中，1、2、3、4、5这5个“大格”正好全部在100X显微镜视场范围。每个“大格”是边长为1mm的正方形，均有16个“中格”。每个“大格”容纳的细胞悬液体积是0.lmm3，即0.lμl或10-4ml。

动物细胞计数时，通常求算1、2、4、5这4个“大格”的平均细胞数，记录的细胞密度“平均细胞数／10-4ml=平均细胞数×104/ml。

（三）单细胞悬液制备

从CO2培养箱取出细胞培养物镜检。混匀使成单细胞悬液。混匀过程注意避免产生气泡，否则影响计数结果，使数值偏低。另外，混匀过程必须温和、充分，否则也会使计数数值偏低。

（四）装载细胞悬液到血细胞计数板

用微量移液器套取吸嘴，吸取混悬均匀的单细胞悬液50-80μl，快速点加至计数板的2个窗口的斜台上，让细胞悬液刚好布满窗口即可。
如有细胞悬液流入计数窗周边的小槽内，则需重新准备计数板，然后再取样。否则计数结果偏低。

如果加载悬液的速度比较慢，计数时容易使数值偏高。

加载细胞悬液的计数板要求10min内计数完结，否则细胞容易坏死，使活细胞计数数值比实际数值低。

（五）计算血细胞计数板读数

利用倒置显微镜的接目镜，在100×视场下读取上方计数窗中4个大方格中的平均细胞数。记录当前计数窗口的细胞密度（(4个大方格中的平均细胞数×104/ml)。

采用相同方法，读取下方计数窗的细胞密度。

实际细胞密度为上、下计数窗的细胞密度数值的平均数。原则上，要求2个计数窗的读数差异控制在5％以内，否则，应重新准备计数板装载细胞悬液进行新一轮的计数。

计数过程中，遵照以下原则：非独立而相连的细胞团计为1，压上线和压左线的细胞计数，压下线和压右线的细胞不计数。

在活细胞计数时，活细胞不包括“大细胞”和“小细胞”。读数顺序是沿16个中格的S形路线读取各中格的细胞数总和。

（六）血细胞计数板用后复原

使用后，及时用酒精棉球擦拭血细胞计数板及其专用盖玻片，复原放置。盖玻片擦拭后放入培养皿，用无水乙醇浸泡。