（一）体外培养细胞的生长与增殖过程

1.概述

培养细胞的生存环境是培养方瓶、培养皿、多孔细胞培养板或其他容器，细胞的生存空间相对孤立，营养是有限的。

贴壁型细胞接种后呈悬浮状态，一般在0.5-4h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24h。

只有接种的细胞密度合适，悬浮型细胞接种后一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入对数增长期。

体外细胞培养生长与增殖过程中采用的常规操作手法包括换液、传代、扩大培养。

2．换液

体外培养的贴壁型细胞在没有完全汇合成单层细胞以前，或悬浮型细胞生长到达极限密度以前，需要及时更换新鲜培养液，一般3-4天更换1次，可以选择全部更换或部分更换，此过程叫换液。

换液操作可避免培养物中因营养物耗竭或废弃物累积增多导致细胞生长抑制甚至细胞死亡的风险。

3．传代

当细胞增殖接近极限密度时，培养物内细胞酸性废弃物累积增多，含酚红的培养液变黄色，必须从中分离出一部分细胞接种到新的培养容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。

从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是，细胞培养一代与细胞倍增的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞总数增加一倍。一般而言，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁细胞的消化传代多用混合的胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从培养细胞的生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持贴壁细胞正常生长状态的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养体系内。悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后，去除原培养液，更换新鲜培养液，然后以一定比例稀释后进行传代。

4．扩大培养

将收集到的细胞按照1：2-l：10的比例接种到更大培养体系的新培养容器中继续培养，适时更换新鲜培养液，此时的操作则称作扩大培养。

细胞传一代以后，细胞群体容易出现密度抑制和营养物耗竭的风险，需要进行传代操作，或进行扩大培养的操作，否则很快进人衰退期，所培养的细胞将在4-16h后坏死、凋亡，甚至全部死亡。

（二）培养细胞的生命期

这里，培养细胞的生命期是指细胞在体外培养中持续增殖和生长的时间或寿命，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。

体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。

组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30-50代，相当于150-300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短，如培养肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。

1．培养细胞的生命期

正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生存的全过程中，大致经历以下三个阶段：

(1)原代培养期（第一期）也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群进行有限稀释做克隆化培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。原代培养细胞多呈二倍体核型。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

(2)传代期（第二期）原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。常用细胞均在不出10代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下可传代10-5。次左右，以后细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。

(3)衰退期（第三期）此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化，多数情况下是发生在传代末或衰退期。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性转化。

细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系，现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。

细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性转化非同一性状。

2.培养细胞的一代生存期

所有体外培养细胞，包括原代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快，因为细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。

细胞培养中，细胞的“一代”仅是指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同，理论上，细胞世代与倍增是同义词。在细胞一代中，细胞可倍增3-6次。

细胞每一次的传代，一般都要经过以下三个阶段：

(1)潜伏期细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养液成分和底物的理化性质等密切相关。原代培养细胞贴附慢，可长达10-24h或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10-30min即可贴壁。

细胞贴壁现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附，底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外，在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素、细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，如CSP；有的则来自培养液中的血清，如LETS。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴壁物质。贴附或薪附是贴壁细胞生长增殖条件之一。

细胞贴附于支持物后，首先经历前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养液性质等密切相关。原代培养细胞潜伏期长，约24-96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6-24h。细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数生长期。

(2)对数生长期这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。对数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。

一般以细胞分裂指数（MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-5%,pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。
对数生长期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。对数生长期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，在接种细胞数量适宜情况下，对数增生期持续3-5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片，继续单层或多层生长。细胞相互接触汇合后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。而恶性细胞或细胞系则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。

(3)稳定期细胞数量达饱和密度后，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制，细胞遂停止增殖，进入稳定期，也称平顶期、停滞期。

此时细胞数量不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。此时期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。
传代过晚会出现细胞中毒现象，影响下一代细胞的活性状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1-2代，通过换液去除死细胞，使受损轻微的细胞得以恢复后才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。