［实验器材]

50-200μl微量移液器，盒装无菌200μl吸嘴，数码倒置荧光显微镜，血细胞计数板，计数板用盖玻片，l0μg/ml二乙酰荧光素溶液，500μg/ml碘化丙啶,PBSA溶液，待检细胞培养物。

［操作步骤]

1．单细胞悬液制备

按照贴壁细胞或悬浮细胞的收集方法进行细胞收集，然后将待检细胞悬液吹打成单细胞悬液，细胞计数。1000r/min离心8min，用PBSA溶液调节细胞密度为2×105-5×105/ml。铺放到96孔或24孔细胞培养板。

2．添加荧光素混合染料

使培养物中二乙酰荧光素和碘化丙咤的终浓度分别为lμg/ml和50μg/ml。37℃CO2培养箱培养10min。

3．装载血细胞计数板

取上述培养孔内的均匀细胞悬液适量，加载到干净的血细胞计数板计数窗内。适宜的加载量是刚好充满计数窗，无溢出，否则需重新清洁血细胞计数板，另行加载细胞悬液。

4.细胞计数

荧光显微镜视场下，发红色荧光的细胞为死细胞，发绿色荧光的细胞为活细胞。在200×或400×的接目镜视场下，求出视场内的活细胞总数、死细胞总数。可拍摄此显微视场下的数码照片，或以此视场进行讨论学习。

5．结果计数

细胞存活率（％）＝（活细胞数／细胞总数）×100%。其中，细胞总数=活细胞总数＋死细胞总数。

［注意事项]

1．二乙酰荧光素的激发波长是450nm/590nm，发射波长是515nm，为绿色荧光。碘化丙啶的激发波长是488nm，发射波长是615nm，为红色荧光。

2.荧光染料溶液需注意避光。

3．细胞悬液需离心去除酚红。