[实验器材]

1．仪器

倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，超净工作台，显微数码摄影系统，8道微量移液器酶标仪，低速冷冻离心机，平板转子。

2．材料与试剂

(1）非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，记号笔。

(2）无菌材料和试剂辅料镊，（圆底）96孔细胞培养板，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度移液管，盒装无菌吸嘴，MTT溶液（(5mg/ml),10%BS-RPMI1640培养液，添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液，lmol/LHCl溶液，DMSO溶液。

(3)细胞材料贴壁细胞培养物或悬浮细胞培养物。

［操作步骤］

1．接种细胞

取对数期生长的贴壁细胞经消化、洗涤后制备的单细胞悬浮液，以一定密度接种在圆底96孔细胞培养板上，每组设3个平行孔，每孔200μl含1000-10000个细胞。

2．培养细胞

将上述96孔细胞培养板移入细胞培养箱，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养18-24h。

3．供试药物与靶细胞共培养

加入供试药物的无菌溶液，或用含无菌供试药物的培养液换液。根据实验需要培养12、24、48、72h等。
含各浓度药物的加药孔设置，以及无细胞对照孔和有细胞无药物对照孔的设置，均要符合数据统计要求。考虑边缘效应，一般设计为加药孔、无细胞孔、无药物孔。

4.MTT共培养

至收获前4h每孔加入20μlMTT溶液（(5mg/ml)，继续孵育4h后终止培养。

5．去除培养液

用8道微量移液器套取无菌吸嘴，小心去除贴壁细胞的培养上清。如果是悬浮细胞，需离心后再吸除上清液。

6．比色

每孔加入DMSO溶液150μl，置酶标仪上振荡10min，以使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。

[注意事项］

1．设空白对照。空白对照为不加细胞只加培养液，其他步骤与实验组相同，比色时以此孔调零。

2．依据实验目的、细胞种类、细胞的生长习性选择适当的细胞接种密度和培养时间长
短。一般情况下，96孔细胞培养板每孔最多可以生长1×105个细胞，切不可接种密度太高，致使培养终止前细胞过满，影响实验的区分度。

3．高浓度的血清会导致实验本底增加，应尽量选择不超过10%BS的培养条件。

4.酚红会影响OD读数，应尽量去除含酚红培养液。

5．最好使用圆底96孔细胞培养板做悬浮细胞的MTT毒性试验。

6．吸除培养上清时，要特别小心，不要把细胞移除。