（一）无菌工艺验证概述

目前，无菌药品的生产工艺主要可以分为两种：一种为最终灭菌工艺，即先将药品的各个部分（产品，容器和密封件）在符合要求的环境下组成最终的包装形式，最后让产品在其最终容器中进行灭菌处理（通常使用热力学灭菌或辐射灭菌）；另一种为无菌生产工艺，即药品的各个部分（产品，容器和密封件）分别经过灭菌处理，再在高洁净度的环境中组装最终产品，且产品装入其最终容器后不再进行任何灭菌处理。相较于最终灭菌工艺，无菌生产工艺易受到多方面因素的影响，产品的无菌性非常脆弱，生产难度更高，且需承担的质量风险也更大。无菌工艺验证是实现产品无菌保证的关键。

无菌工艺验证，是指证明按照预定的工艺规程使用的设备和包装材料能够始终如一的生产出符合要求的无菌产品，从而确认无菌生产工艺系统的可靠性和适应性。最为常用的无菌工艺验证方法是培养基灌装试验，即采用正常生产的灌装程序，用培养基代替产品灌封，来模拟无菌灌装操作的无菌性。除培养基灌装试验外，无菌工艺验证的方法还包括无物料模拟试验、空白物料模拟试验和产品物料模拟试验。

鉴于无菌工艺验证的重要性，2011年3月颁布的GMP的附录1无菌药品的第四十七条就对此作出了如下规定。

无菌生产工艺的验证应当包括培养基模拟灌装试验。

应当根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。应当尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对无菌结果有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。

培养基模拟灌装试验的首次验证，每班次应当连续进行3次合格试验。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养基模拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应当按照生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。

培养基灌装容器的数量应当足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应当至少等于产品的批量。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应当遵循以下要求：

1．灌装数量少于5000支时，不得检出污染品。

2．灌装数量在5000至10000支时：

（1)有1支污染，需调查，可考虑重复试验；

(2)有2支污染，需调查后，进行再验证。

3．灌装数量超过10000支时：

（1)有1支污染，需调查；

(2）有2支污染，需调查后，进行再验证。

此外，国外权威药监机构与行业协会也发布了相关的指南、技术报告等：美国FDA发布了《无菌工艺生产的无菌药品的cGMP行业指南》；欧盟则在EUGMP的附录1中做出了相应规定；国际药品检查协作组织（PIC/S)则发布了《无菌工艺验证的指导意见》；美国注射剂协会（PDA）分别发布了关于原料药和制剂无菌工艺验证的技术报告等。

（二）无菌工艺验证的条件

无菌工艺验证的条件基本与常规工艺验证的条件基本相同，主要包括下述五个方面。

(1)完成相关生产厂房和设施的确认，包括生产厂房的设计评价与确认、HVAC系统确认、水系统确认、蒸汽系统确认等。

(2）完成相关生产设备的确认，包括对设备的清洗和消毒程序的确认。

(3）完成生产所涉及灭菌工艺（如湿热灭菌工艺和干热灭菌工艺）验证。

(4）完成容器／胶塞密闭性测试。

(5)完成除菌过滤系统的验证。

(6)完成生产相关人员的无菌工艺培训。

（三）无菌工艺验证要点

下文以最为常用的培养基灌装试验为例，详述无菌工艺验证实施过程中的关键要点。

1．培养基的选择

培养基作为无菌工艺验证的载体，将对最终的验证效果起到关键作用。常见的培养基包括大豆胰蛋白肉汤、聚乙二醇、乳糖和（或）肉汤等。因此，所选用的培养基应当具备以下特征。

(1)无抑菌作用，适应广谱微生物生长。如果培养基具有抑菌作用，将会对生产系统中的细菌生长产生抑制作用，以至于不能正常培养出细菌，从而产生假阴性结果。因此，应当对所选培养基进行促生长试验（灵敏度试验），以确保其对细菌具有促进生长的作用。

(2)较好的澄明度，较小的勃度，便于验证试验操作和培养结果的观察。

(3）易于灭菌，如培养基可被除菌过滤。

2.“最劣工况”理念

“最劣工况”理念是药品生产验证中最重要的原理之一，其应用原理是指对工艺、系统或设备提出相比于正常生产情况更大的挑战，如果在存在更大挑战的情形下都可以获得可接受的结果，则就更有信心相信在正常生产情况下系统将会有更高的可靠性。“最劣工况”理念非常适用于无菌工艺验证，常见的“最劣工况”情形如下。

(1)使用超出灭菌有效期的但仍保存在无菌工艺区的物料、设备、器具和其他物件。

(2)生产人数超出正常生产的最大限额。

(3)延长灭菌完成与无菌工艺验证开始的时间间隔。

(4）使用促生长性强的培养基。

(5)验证过程应当包括正常的和非正常的干扰，干扰的次数应当不少于正常生产时发生的次数。

(6)在生产完最后一批产品时实施无菌工艺验证。

(7)如果生产所用工艺气体为氮气，则在验证过程中可换用更利于微生物生长的压缩空气。

此外，可以运用危害分析法、危害分析和关键点控制法、故障模式效应分析法和故障树分析法等风险分析方法为特定的无菌生产工艺设定适当的最劣工况。

3．验证规模

无菌工艺验证的规模应当达到统计学无菌要求，即能检出95％置信度下0.1％的污染率。通常．培养基灌装试验的灌装数量为5000-10000瓶。如果生产批量较小（小于5000瓶），则全批灌装。

4．验证次数

对于初次验证，即对新的无菌工艺进行验证，每班次应当连续进行3次合格试验，且应有足够的时间模拟实际生产时的操作，包括所有对无菌结果有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和引入“最劣工况”。

当空气净化系统、设备、生产工艺及人员等重大变更后，应当重复进行培养基模拟灌装试验，以确保变更后的无菌工艺的可靠性。

无菌工艺应当定期再验证，培养基模拟灌装试验通常应当按照生产工艺每班次半年进行1次，每年进行2次，每次至少一批。

5．验证流程（以培养基灌装试验为例）

（1)确认设施设备和各灭菌工艺验证的完成。

(2）确认培养基灌装的范围。

(3）制订培养基灌装试验方案

(4）执行培养基灌装试验方案。

(5)培养基促生长试验（灵敏度试验）。

(6）结果评价与失败调查。

6．环境监测

无菌工艺对于生产环境的要求极高，因此在生产过程中应当全面、全过程地监测环境，这点同样适用于无菌工艺验证的过程。环境监测的内容包括温度、湿度、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌以及人员和表面微生物，并留有相应的环境监测记录。所有监测应当设置在生产环境的最脏处（即“最劣工况”处）。此外，所有监测指标均应分别设置警戒限（AlertLevel)和行动限（ActionLevel)，并书面规定当超过上述限度时所应采取的纠正措施。

7．样品收集与培养

在完成培养基灌装后，试验样品按灌装的先后顺序轧盖，将轧好盖的瓶子翻转，放入按顺序编号的周转箱内，并注明收瓶时间。

全部样品应在20-25℃和30-35℃下分别培养7天，共培养14天，每天检查全部样品的微生物生长情况，并设阴性对照和阳性对照。在整个培养期间，应当连续地控制和监测所选定的培养温度。在中间转换温度和培养结束时应当对所有样品进行灯检，若发现污染应注明批号、包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别。

8．结果评价与失败调查

无菌工艺验证的目标是所有灌装的培养均不存在任何污染。不论灌装批量有多大，只要培养基灌装中存在污染就意味着无菌保证存在问题。设计合理、操作得当的无菌工艺的污染水平应为零。

如果培养基灌装试验失败，应当对失败的原因进行调查，并在已完成相应整改后，方重新进行验证。失败调查主要可从以下方面入手。

(1)环境和人员监测数据；

(2）灭菌记录和设备校验记录；

(3)灌装区域清洁消毒记录；

(4)人员培训记录；

(5)高效过滤器完整性测试记录；

(6)压差记录；

（7）溶液除菌过滤器完整性测试记录；

（8)污染菌来源；

(9）丢弃的培养基灌装瓶；

(10）灌装时的干扰活动；

(11)其他偏差和干扰活动。

如果在调查中发现了失败原因，则应立即进行整改并留有整改记录；如未能发现失败原因，则该工艺应当按照新的工艺重新进行验证。