根据中国合格评定国家认可委员会认可证书（注册号：CNA5L0604)推荐，大肠菌群与大肠埃希氏菌类检测和计数的AOAC方法为AOAC991.14Petrifilm大肠菌群测试片、Petrifilm大肠埃希氏菌类测试片法和AOAC998.08再水化干膜法。这两种方法都同时可以测定大肠菌群和大肠埃希氏菌类，不同是适用范围的区别。这里对AOAC991.14做简要介绍。

(1)原理Petrifilm大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB(Vi-oletRedBile）培养基，冷水可溶性凝胶和2,3,5-氯化三苯四氮哇(TTC）指示剂，可增强菌落计数效果，表面覆盖的胶膜，可以截留大肠菌群产生的气体，培养结束后计数红点周围有气泡的菌落为大肠菌群。

Petrifilm大肠菌群测试片／大肠埃希氏菌类测试片：是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB(VioletRedBile）培养基，冷水可溶性凝胶、葡萄昔酶指示剂5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酶（用于大肠埃希氏菌类）和2,3,5-氯三苯四哇（用于大肠菌群）。绝大多数E.coli（约占97%）能产生价葡萄糖昔酸酶与培养基中的指示剂发生反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠埃希氏菌类菌落周围，表面覆盖的胶膜可以截留大肠菌群产生的气体。培养结束后，蓝点带气泡的为大肠埃希氏菌类菌数，红点带气泡和蓝点带气泡菌落的总数为大肠菌群数。这样就能在同一张测试片上识别大肠菌群和大肠埃希氏菌类。

(2)检验程序AOAC官方方法991.14的检验程序见图3-13.

图3-13AOAC官方方法991.14的检验程序

(3)操作步骤

①样品制备：称取50g的测试样品置于无菌搅拌罐中。以10000~12000r/min的转速搅拌2min，使其均质。如果全部的测试样品质量小于50g，称取样品并加入无菌稀释液，以1:10的比例进行稀释。除非另有说明，用90mL的无菌稀释剂和10mL的前次溶液相混合以制备十倍递减的稀释溶液。以30cm/s的速度左右剧烈摇晃25次。移液管必须精确移取所需体积的溶液。不要用移液管移取小于本身体积10％的溶液。比如，不要用10mL以上的移液管移取1mL的溶液；不要用1mL以上的移液管移取0.1mL溶液。

②检测操作：将Petrifilm测试片置于水平表面。提起上层膜，将1mL样品接种于测试片的中央。小心将上层膜覆盖在接种面上。向塑料压板（平面向下）的中心轻轻施压，将样品均液均匀地分布于20cm2，的生长区域。并将测试片静置至少1min，以使凝胶固化。将测试片在35℃下培养（(24±2)h。将测试片水平朝上放置于培养器中。每叠不要超过20个。

在培养结束之后及时计数。

③计数与结果报告：使用标准菌群计数器计数，也可以使用放大镜辅助计数。选择蓝色带气泡菌落（在一个菌落直径之内）为大肠埃希氏菌类并计数。带气泡的红色菌落为其他非大肠埃希氏菌类的大肠菌群的菌落。在合理计数范围（15-150个）内计算所有的菌落数。如果所有测试片上的菌落数均小于15个，记录最小稀释度的测试片上的实际菌落数。

如果所有测试片的菌落数都大于150，通过计算一个或者多个的具有代表性的方格中的菌落数，然后估算菌落数，确定每个方格的平均菌落数，并将这平均数值乘以20（每个纸片上的有效计数面积为20个小方格）。如果菌落分布过于密集，导致难以估算菌落数，将这种情况记录为多不可计。最后按稀释倍数换算即可。如果对大肠埃希氏菌类计数，使用大肠埃希氏菌类测试片，并用与以上相同的方法处理。再多培养（24±2)h（总计48h±4h)。大肠埃希氏菌类为含有气泡的蓝色菌群，其他非大肠埃希氏菌类的大肠菌群为带气泡的红色菌群，二者之和为大肠菌群数。