色谱分析是20世纪初在研究植物色素分离时发现的一种物理的分离分析方法，借以分离和鉴别结构与物理化学性质相近的一些有机物质。长期以来，经不断改进，已成功地发展为各种类型的色谱分析方法。由于它具有高效、灵敏、准确等特点，已广泛地应用在有机化学、生物化学的科学研究和有关的化工生产等领域内。

色谱分析是以相分配原理为基础，它基于分析试样各组分在不相混溶并作相对运动的两相（流动相和固定相）中溶解度的不同，或在固定相上的物理吸附程度的不同等，即在两相中分配的不同而使各组分分离。

分析试样可以是气体、液体或固体（溶于合适的溶剂中）。流动相可以是惰性载气、有机溶剂等。固定相则可以是固体吸附剂、水、有机溶剂或涂渍在担体表面上的低挥发性液体。

目前常用的色谱分析法有：①柱色谱法；②纸色谱法；③薄层色谱法；④气相色谱法。这里只介绍前三种。

柱色谱法

20世纪初，人们就开始应用柱色谱法来分离复杂的有机物。在分离较大量的有机物质时，柱色谱法在目前仍是有效的方法。

柱色谱法涉及被分离的物质在液相和固相之间的分配，因此可以把它看作是一种固一液吸附色谱法。固定相是固体。液体样品通过固体时，由于固体表面对液体中各组分的吸附能力不同而使各组分分离开。

柱色谱法是通过色谱柱（图2.31）来实现分离的。色谱柱内装有固体吸附剂（固定相），如氧化铝或硅胶。液体样品从柱顶加入，在柱的顶部被吸附剂吸附。然后从柱的顶部加入有机溶剂（作洗提剂）。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，各组分以不同的速率下移，被吸附较弱的组分在流动相（洗提剂）中的百分含量比被吸附较强的组分要高，以较快的速率向下移动。

各组分随溶剂按一定顺序从色谱柱下端流出，可用容器分别收集之。如各组分为有色物质，则可以直接观察到不同颜色的谱带，但如为无色物质，则不能直接观察到谱带。有时一些物质在紫外光照射下能发出荧光，则可用紫外光射。有时则可分段集取一定体积的洗提液，再分别鉴定。如果有一个或几个组分移动得很慢，可把吸附剂推出柱外，切开不同的谱带，分别用溶剂萃取。

选择吸附剂时，需考虑以下几点：不溶于所使用的溶剂；与要分离的物质不起化学反应，也不起催化作用等；具有一定的组成；一般要求是无色的，颗粒大小均匀。颗粒越小，则混合物的分离程度越好，但溶液或溶剂流经柱子的速度也就越慢，因此要根据具体情况选择吸附剂。

最广泛使用的吸附剂是活性氧化铝，非极性物质通过氧化铝的速率较极性物质为快。有一些物质由于被吸附剂牢牢吸附，将不能通过。活性氧化铝不溶解于水，也不溶于有机溶剂，含水的与无水的物质都可使用这种吸附剂。

吸附剂的吸附能力不仅取决于吸附剂本身，也取决于在色谱分离中所用的溶剂，因此，对不同物质，吸附剂按其相对的吸附能力可粗略分类如下：

①强吸附剂：低水含量的氧化铝、活性炭。

②中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、氧化镁。

③弱吸附剂：蔗糖、淀粉、滑石。

吸附剂的吸附能力取决于溶剂和吸附剂的性质。一般来说，先将要分出的样品溶在非极性或极性很小的溶剂中，把溶液放在柱顶，然后用稍有极性的溶剂使各组分在柱中形成若干谱带，再用更大极性的溶剂洗提被吸附的物质。例如，以石油醚作溶剂，用苯使谱带展开，再用乙醇洗提不同谱带。当然，也可以用混合溶剂，如石油醚一苯、苯一乙醇等洗提。

普通溶剂的极性增加顺序大致如下：

石油醚、四氯化碳、环己烷、二硫化碳、苯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水、吡啶、乙酸。

色谱柱的尺寸范围，可根据处理量决定，柱子的长径比例很重要，一般长：径=10:1比较合适。

将柱子洗净、干燥。在管的底部铺一层玻璃棉，在玻璃棉上覆盖约5mm厚的沙子，然后装入吸附剂。吸附剂必须装填均匀，不能有裂缝，空气必须严格排除。具体有两种装填方法：

①湿法：将玻璃棉和沙子用溶剂润湿，否则柱子里会有空气泡。将溶剂和吸附剂调好，倒入柱子中，使它慢慢流过柱子，使吸附剂装填均匀。也可以用铅笔或其他木棒敲打，使吸附剂沿管壁沉落。

②干法：加入足够装填1一2cm高的吸附剂，用一个带有塞子的玻璃棒做通条来压紧，然后再加另一部分吸附剂，一直达到足够的高度。不论用哪种方法，装好足够的吸附剂以后，再加一层约5mm厚的沙子，不断敲打，使沙子上层成水平面。在沙子上面放一片滤纸，其直径应与管子内径相当。

装好的柱子用纯溶剂淋洗，如果速度很慢，可以抽吸，使其流速大约为0.25滴·s^-1，连续不断地加溶剂，使柱顶不变干。如果速度适宜，当在沙层顶部有1mm高的一层溶剂时，即可将要分离的物质溶液加入，然后用溶剂洗提。

已经润湿的柱子不应再让其变干，因为变干后吸附剂可能从玻璃管壁离开而形成裂沟。

例如，甲基橙与亚甲基蓝的分离。

把2.2ml质量分数95％乙醇溶液（内含1mg甲基橙和5mg亚甲基蓝）倒入色谱柱内，当混合物液面与沙层顶部相近时，加入质量分数95％乙醇，这时亚甲基蓝的谱带与被牢固吸附的甲基橙谱带分离。继续加足够量的质量分数95％乙醇，使亚甲基蓝全部从柱子中洗提下来。待洗出液呈无色时，换水作洗提剂。这时甲基橙向柱子下部移动，用容器收集。