食品中产气荚膜梭菌的检测

食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）属于梭菌属，为厌氧芽孢菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典型的食物中毒。

一、基本知识

1.生物学特性

(1)形态和染色产气荚膜梭菌菌体两端钝圆，直杆状，(1-2)um×(2-10)um，革兰氏阳性、无鞭毛，芽孢呈椭圆形，位于次级端或近中央，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽孢，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。

(2）培养特性产气荚膜梭菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，甚至在Eh 200-250mV的环境内也能生长。生长适宜温度为37一47℃，多认为43-47℃是菌体生长和繁殖的最适温度。在适宜条件下增代时间仅8 min，可利用高温快速培养法，对本菌进行选择分离。在普通琼脂平板上培养15h左右可见到菌落，呈凸面状，表面光滑半透明，正圆形，在营养成分不足或琼脂浓度高的平板上，有时尤其经过传种的菌株，可能形成锯齿状边缘或带放射状条纹的R型菌落。血琼脂平板培养3-4 h即见生长，24h菌落直径可达2-4mm，圆形、扁平、半透明、边缘整齐。在血琼脂平板上，多数菌株有双层溶血环，内环是由θ毒素引起的完全溶血，外环是由a毒素引起的不完全溶血。在蛋黄琼脂平板上出现Nagler反应；在庖肉培养基中可分解肉渣中糖类，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化，产生大量气体；在牛乳培养基发生“汹涌发酵”。

(3)生化特性气荚膜梭菌的所有菌株都能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；液化明胶；不产生靛基质；硝酸还原酶阳性，还原硝酸盐为亚硝酸盐；能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。牛乳培养基中能分解乳糖产酸，使其中酪蛋白凝固；同时产生大量气体（H₂和CO₂)，可将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，将液面封固的凡士林层上推，甚至冲走试管口棉塞，气势凶猛，称“汹涌发酵”(stormy fer-mentation)。这是本菌的主要生化特征之一，也是主要鉴别的指标。在蛋黄琼脂平板上，细菌产生的卵磷脂酶(a毒素）分解蛋黄中卵磷脂生成磷酞胆碱与非水溶性甘油二酸酯，在菌落周围出现乳白色浑浊圈，这一现象称为Nagler反应（纳格勒氏反应，Nagler's reaction) ,为本菌的特点；由于卵磷脂酶具有抗原性，它的活性可被相应抗血清所中和，若在培养基中加入a毒素的抗血清，则可中和a毒素，在菌落周围不出现浑浊圈。

(4）毒素产气荚膜梭菌能产生10余种外毒素，有些外毒素即为胞外酶，可引起典型的食物中毒。根据产气荚膜梭菌的4种主要毒素（a、β、ε、ι）产生情况，可将其分为A,B, C, D, E 5个毒素型。

①外毒素：各型产气荚膜梭菌产生的外毒素（或可溶血抗原）共有12种，其中主要有4型，即A, B, C, D，而已知“A型”毒素与人类食物中毒有关。

②肠毒素：A型产气荚膜梭菌的耐热株能引起人的食物中毒，关于产气荚膜梭菌食物中毒的发病机制，基本认为是，被耐热性A型产气荚膜梭菌芽抱污染的肉、禽等生食品，虽经烹制加热，但芽孢不仅不死灭，反而由于受到“热刺激”，在较高温度长时间储存（即缓时冷却）的过程中芽孢发芽、生长、繁殖，而且随食物进入人肠道的这些繁殖体容易再形成芽孢，同时产生肠毒素，聚集于芽孢内，当菌体细胞自溶和芽孢游离时，肠毒素将被释放出来，人、猴、犬等口服人工提取的该肠毒素能引起腹泻。

人和动物对产气荚膜梭菌的毒素的免疫主要表现为抗肠毒素的产生，健康者血清常含有抗肠毒素，似乎表明产气荚膜梭菌作为正常菌群，在肠道内可能在不断地产生着肠毒素。

产气荚膜梭菌为厌氧芽孢菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。摄食被本菌污染的食品后6-24h开始发病。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×10⁷或更多），才能在肠道中产生毒素，病程通常在24h内，但某些个体的不显著症状可能会持续1-2周，已报道有少数患者因脱水和其他混合感染而导致死亡。

据美国人类卫生教育福利部报道，魏氏梭菌引起的食物中毒在美国占细菌性食物中毒的30％左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报道1200例，爆发约20起。大量的爆发和少量的发病都与公共饮食有关，例如学校的自助食堂和护理病房。产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。

产气荚膜梭菌易于形成芽孢，芽孢的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽抱能耐受100℃ 1-5h的加热。除了具有形成芽抱及耐热等特点之外，生化性状、毒素及酶的特异性等与其他魏氏梭菌是一致的。

2、致病性

产气荚膜梭菌毒素对人致病的主要为A型，A型很容易从外环境中分离到，属人和动物肠道正常菌群；B-E群在土壤中不能存活，主要寄生于有免疫力的动物肠道内。食品中污染该菌到一定数量(1.0×10⁷或更多时）往往在摄食后才能在肠道中生产毒素引起食物中毒。潜伏期约10h，临床表现为腹痛、腹胀、水样腹泻；无热、无恶心呕吐。1-2d后自愈。

产气荚膜梭菌广泛分布存在于土壤、人和动物肠道中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽孢。牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、炯肉、红烧蔬菜、炖肉和肉汁中常常能够分离到产气荚膜梭菌。因此，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物以及加热不彻底的牛乳。此外，不少熟食品，由于加温不够或中途污染而在缓慢的冷却过程中，菌体大量繁殖并形成芽抱产生肠毒素，其食品并不一定在色香味上发生明显的变化，但是人们误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发生食物中毒。

二、常用培养基及检测原理

(1)胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂胰胨、大豆蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖和乳糖为可发酵糖类提供碳源；偏亚硫酸氢钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；卵黄含有卵磷脂，可检测某些含卵磷脂酶的梭菌；D-环丝氨酸抑制非梭菌的细菌。

(2)液体硫乙醇酸盐培养基（FTG)胰酪胨和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供可发酵用糖类，更利于生长；氯化钠维持均衡的渗透压；硫乙醇酸钠和L-胱氨酸能有效降低氧化还原电位，防止过氧化物的积累对某些菌产生毒性，同时其硫氢基团有钝化含砷、汞及其他重金属防腐剂的抑菌作用；少量琼脂的凝固作用可防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散；刃天青是氧化还原指示剂，氧化状态呈粉红色，还原状态无色。

三、国家标准检验方法

参照GB 4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。

1.检验程序

产气荚膜梭菌检验程序见图4-26 。

2、操作步骤

(1）样品制备

①样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2-5℃保存；如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g (25mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

②以无菌操作称取25g (25mL)样品放入含有225mL 0.1％蛋白胨水（如为冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL 0.1％蛋白陈水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1-2min；或置于盛有225mL 0.1％蛋白胨水的均质杯中，8000～10000r/min均质1-2min，作为1:10稀释液。

以上述1：10稀释液按1mL加0.1％蛋白胨水9mL制备10-2.10-6的系列稀释液。

(2）培养吸取各稀释液1mL加入灭菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂［可放置于（50±1)℃恒温水浴箱中保温］15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

上述琼脂平板凝固后，再加lOmL冷却至50℃的TSC琼脂［可放置于（50±1)℃恒温水浴箱中保温］均匀覆盖平板表层。
待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，于（36±1)℃培养20-24h。

典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。

(3)确证试验

①从单个平板上任选5个(小于5个则全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，于(36±1)℃培养18-24h。

②用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽抱体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，(36±1)℃厌氧培养20-24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，(36±1)℃培养18-24h，用于后续的确证试验。

③取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在（46±0.5)℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“汹涌发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“汹涌发酵”现象，但培养基不变黑。

④用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力一硝酸盐培养基，于（(36±1)℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

⑤用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖一明胶培养基，于（36±1)℃培养24h,观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于（36±1)℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。

(4）结果与报告选取典型菌落数在20-200CFU的平板，计数典型菌落数。如果如下。

①只有一个稀释度平板的典型菌落数在20-200CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落。

②最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落。

③某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落。

④某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20-200CFU，应计数该稀释度平板上的典型菌落。

⑤2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20.200CFU，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。
以上计数结果按下式计算。

式中，T为样品中产气荚膜梭菌的菌落数；A为单个平板上典型菌落数；B为单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；C为单个平板上用于确证试验的菌落数；二，为第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n1为第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；d为稀释因子（第一稀释度）；0.1为稀释系数。
根据TSC琼脂平板上产气英膜梭菌的典型菌落数，按照上式计算，报告每克（每毫升）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g (CFU/mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。