常见产毒霉菌的分离

各类谷物和食品由于受到霉菌的侵染，不仅会发生霉坏变质，在经济上建成巨大损失，而见还可能带染各种不同性质的霉菌毒素，人和家畜、家禽食入后，常常会导致急性和慢性的中毒病，以往在医学范畴中尚未引起人们的足够重视。1960年，英国从火鸡爆发的中毒病中发现了黄曲霉毒素，并由Lancaster证明这种毒素是一种强烈的致肝癌物质，以后，许多工作者又陆续发现杂色曲霉素、赭曲霉毒素、展青霉素等，也均具有较强烈的致癌性。此外，还发现了一些威胁人和家畜健康的镰刀菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（致呕毒素）、T-2毒素、镰刀菌烯酮-x、雪腐镰刀菌烯醇。M、玉米赤霞烯酮、新茄病镰刀菌烯醇和丁烯酸内酯等。所以，在霉菌侵染谷物和食品的问题上，已越来越引起世界各国的极大注意。

1、样品的采集

为了解各类谷物和食品中霉菌的侵染情况，在采集样品时必须注意样品的代表性和避免污染。因为这关系到整个分析结果的正确性。在采样前应事先准备好灭菌的容器和采集工具，如牛皮纸袋、磨口瓶、捡样器和金属小勺等。由于微生物广泛存在于自然界中，所以从采样直到进行分析的过程中，要时刻严防污染。取样距离分析的时间愈短愈好，必要时应放在低温干燥的地方保存。

2、粮食样品的采集

(1）粮库贮粮在采样前，观察并记录采样囤垛周围环境的卫生状况，外界温度和湿度，粮食的来源，储存时间，粮食质量和水分，有无霉变现象，以及当时的粮温变化等情况。

①粮囤：根据囤型的大小分层定点采样，一般可分为3-4层（每层距离可按lm左右间隔）。每层进行五点取样，前后左右四点用短扦样器探入约30cm深度取样，中心部位的取样可用长扦样器，先将探口向下探至中心部位后，将探口翻转向上，进行取样，所取各层样品装入一灭菌容器内，封闭容器充分混匀，留下半斤左右取回实验室。

②粮垛和粮堆，与上述粮囤的取样方法大同小异。由于粮垛和粮堆的中心部位不易采取，可根据垛型和粮堆的大小，分层随机采取不同点的混合样品。

(2)小量贮粮一般在卫生学调查的基础上进行病区和非病区家庭或零售粮店的采样。采样时可根据现场的实际情况酌定，通常使用金属小勺采取上中下各部位的混合样品。

3、食品样品的采集

(1)谷物加工制品包括熟饭、面包、糕点、米粉和黏糕类等。首先亦应在卫生学调查的基础上采取具有代表性样品。将可疑食品用无菌工具（刀、剪和镊等）采集250g左右，放入灭菌牛皮纸袋或其他无菌容器内，严密封妥后取回实验室。

(2)各类发酵食品按上述无菌操作手续采取成品及其制作过程中的半成品200-300g。

(3）乳制品如乳制品储存过久出现发霉现象，采集方法和数量应具有代表性。

4、动物饲料样品的采集

采集动物饲料样品包括干草等一般饲料、发酵饲料（如糖化饲料）以及发霉的谷物等，仍按上述原则进行采样。

二、霉菌的分离

2.1培养基的选择

在贮粮和食品中产生毒素的霉菌主要为镰刀霉、青霉和曲霉菌属的一些菌类，其中有些菌种是耐高渗压的，因此分离这类霉菌除考虑其营养要求外，还要适当地提高培养基的渗透浓度，一般可在察氏培养基中增加食盐或糖分的含量，称为高渗察氏培养基。此外，还需同时选用一种低渗培养基，如马丁培养基或马铃薯葡萄糖培养基，这样才能确切地反映谷物和食品中霉菌侵染的全貌。

2.2粮粒表面除菌

为了分离潜伏在粮粒内部的霉菌，在进行分离培养前，需先消除粮粒表面沾染的霉菌，目前使用的粮粒表面杀菌剂很多，但都不太理想。由于霉菌在粮粒组织内部主要分布在皮层和胚部，鉴于这些部位，特别是脱壳的粮粒，很容易或多或少地受到药物渗入的影响，有时不能反映粮粒内部受到霉菌侵染的全部情况，因此采取单纯使用无菌水多次洗涤的方法，既可将附着在粮粒表面的霉菌及其抱子洗除，又可使粮粒组织内部侵染的全部霉菌在分离培养过程中不受影响。

粮粒表面洗涤除菌的方法比较简便，取粮粒样品10-20g放入灭菌的150mL三角瓶中，如为带壳粮粒，可先放入75％酒精浸泡1-2min以脱除粮粒表面的蜡质（脱壳粮粒可省略此步），倾去酒精后，再以无菌操作手续倒入灭菌蒸馏水约50mL，或淹没粮粒1-2cm左右，盖好棉塞，充分振荡1-2min，将水倒净，再换水振荡，如此反复洗涤10次，最后将水弃去备用。

2.3粮粒内部霉菌的分离

(1)粮粒的直接接种法粮粒内部的霉菌分离主要应用此法。以无菌操作手续，用灭菌的小镊子将表面除菌的粮粒样品胚部向下种在改良察氏琼脂平板上。接种时需按等距离排列，并微加压力使其紧附或刺入培养基中。每块平板可按种5-10粒（大粒者接种5粒，小粒者可按种10粒），每份样品共种100粒。样品接种完毕，立即置28℃培养1周后开始进行检查。

(2)粮粒切开接种法此法操作手续比较麻烦，仅供参考。因为大粮粒如玉米、大豆和花生米等的直接接种，在培养期间可能出现由于粮粒发芽顶开皿盖，而使培养物遭到污染。所以使用粮粒切开接种法，一股可以避免上述情况的发生，即粮粒洗涤除菌后先放在无菌容器内，用灭菌刀或剪将粮粒切开两半或只切取其胚部，再用灭菌镊子将半颗粮粒或其种胚放入琼脂平板上，使粮粒的切开面紧贴附于培养基表面，然后置于28℃培养1周后观察菌落生长情况。

2.4加工食品霉菌的分离

(1)粉状食品接种法以无菌操作手续称取样品5g，放入装有50mL灭菌蒸馏水的大试管中，用力充分振摇并用吸管反复吸吹，此液即为1：10稀释掖，然后再按1：100,1：1000进行稀释，将其三个倍数稀释液各取1mL，分别放入无菌平皿中，做倾注培养。

(2）块状食品的接种以无菌手续用小刀切取样品的各个部位称取1g或2g，用小摄将碎块等距离接种在改良察氏琼脂平板上，接种前后要尽量避免外界的污染。

上述样品按种完毕后，置28℃培养1周进行检查。

2.5可疑饲料霉菌的分离

除发霉谷物按照上述粮粒接种方法外，如为干草类饲料，则用灭菌剪刀在无菌器皿中将其剪成碎段称取1g或2g，然后用灭菌小镊将碎段按等距离接种在改良察氏琼脂平皿上，置28℃培养1周进行检查。

2.6结果判断和记录

(1)粮粒培养的检查在培养期间应随时观察并标记100粒粮粒中生长霉菌的粮粒和菌落，最后记录其受霉菌侵染的粒数和菌落生长的总数，综合判断粮粒霉菌污染的情况，然后制片镜检进行初步分属和分群。

(2）粉状加工食品的培养检查一般定量稀释做倾注培养的样品，均需进行菌落计数，观察并记录每克样品中霉菌污染的数目。菌落检查步骤同上。

(3)块状食品和饲料的培养检查如按定量接种的样品，亦需首先进行菌落计数，同样记录每克样品中霉菌污染的数目，菌落检查步骤同上。