霉菌的鉴定

目前所发现的对人类和动物能引起食物中毒的产毒霉菌，主要包括曲霉属、青霉属和镰刀菌属的一些菌种。这里仅将这些有关的霉菌属的分类系统和代表性产毒菌种加以介绍。

一、曲霉属

这个菌属在自然界分布极广，许多菌种具有分解有机物质和产生多种有机酸的能力，其中不少是重要的工业霉菌；另外有些菌种，寄生于食品、贮粮和动物饲料后，不但能引起发热霉坏，甚至还产生致癌性毒素。一些重要产毒的菌种，如黄曲霉、寄生曲霉、赭曲霉和杂色曲霉等，在当前已引起有关方面的注意。

曲霉属在Raper和Fennell的分类系统中共分18个群、123个种和18个变种。一般说来，大部分菌种的培养性状相对稳定，因此在鉴定工作中，与其他菌属相比较并不太困难。通常初分离时，首先要获得纯培养，然后接种在标准鉴定培养基上，于26℃培养2周，在培养过程中，要随时注意观察其培养特性的逐步变化。

目前采用的标准培养基，按照Raper和Fennell的《曲霉属》一书的规定，主要为察氏琼脂培养基，另外还可选用麦芽汁琼脂和玉米浆琼脂作为鉴定辅助培养基。

(1)接种和培养曲霉的菌落形态特征，是在鉴定时的一项重要依据。为了便于观察，通常用平板培养。用接种钩从斜面纯培养物中蘸取少量抱子，点种在平板上，每块平板一般接种1-3个菌落，在培养后的第4, 7, 10和14天观察其生长速度和菌落特征。

(2)培养特性的观察

①肉眼观察：接种的平板，在培养过程中，需要在一定时间进行肉眼观察（必要时可借助于放大镜），并详细地记录菌落的外观。

a．生长速度；记录菌落生长的快、中、慢、极慢。一般在培养2周时测量菌落的直径(cm)。

b．菌落的颜色：有些菌株在培养期间，菌落颜色变化很大，主要观察菌落表面（包括子实体、气生菌丝和菌核等）和底部埋伏型菌丝在不向阶段的颜色及其变化，菌落反面的颜色及其变化等。

c．菌落的表面：气生菌丝生长疏松或致密；平坦、隆起、凹陷或有皱褶，有无同心环或放射沟纹，边缘是否整齐，是全缘的、锯齿状的，还是树枝状和纤毛状等。

d．菌落的质地：指菌落的外观似毡状、绒状、棉絮状、羊毛状、束状、粉粒状、明胶状或皮革状等类型。

e．培养基颜色及其变化：观察是否仅限于菌落所覆盖的部分，还是扩散于更大范围。

f．渗出液：有些菌种常常在菌落表面出现带颜色的液滴。观察时应注意其色调和分泌的数量。

g．气味：菌落的气味较难描述，许多菌株在培养过程中有霉味、土气味和芳香味等，但也有很多菌株不产生气味。

②显微镜检查

a．活培养检查：将培养物（斜面、平板和微量培养）放在载物台上，用低倍镜观察子实器官的特性和排列，如抱子穗的形态、抱子链的排列和分生抱子梗的生长方式等。

b．制片检查：主要观察子实器官的细微结构，如顶囊的形状和大小，小梗的排列（单层或双层）和长度，分生抱子的形态、大小、颜色和表面的细微结构，分生孢子梗的长度、颜色、表面光滑或粗糙以及有无闭囊壳和壳细胞等。

在制片时，菌种的培养时间很重要，培养物太幼时，子实结构及抱子还未发育完好，太老时，子实结构又会散落乃至解体，具体情况要根据不同菌种而定。一般说来，合适的菌龄是在培养4-7d，如用培养皿点种培养时，在菌落蔓延过程中，可由菌龄合适的地方挑出一块来制片。

制片的方法和其他霉菌制片一样，滴一小滴乳酸苯酚液于清洁载玻片中央，用无菌钩从培养物上挑取少量的典型材料，放于液滴中，再用两根针将材料小心撕开到全部打湿，然后盖上盖片轻轻按压，如有气泡可慢慢加热除掉。

A、黄曲霉(A. flavus Link)

［菌落】在察氏琼脂培养基上变化不定，于24-26℃培养10d，生长较快的直径可达6-7cm，生长缓慢的直径为3-4cm。通常由略薄而质地紧密的基部菌丝所组成，这种基部菌丝在某些菌株中一直埋伏于边缘的1.0-1.5cm处，一般呈扁平状，但偶尔也出现放射沟或皱褶呈脑状，大部分菌株直接从基质菌丝上产生丰富的分生抱子结构，幼龄的分生孢子头通常呈黄色或黄柠檬色，很快通过亮色到暗黄绿色，近乎灰绿色或淡榆绿色，老时最后变成深葡萄绿色至玉绿色或水芹绿色。反面一般无色到粉淡褐色。在大量产生菌核的菌株中，呈暗红至褐色。渗出液除大量产生菌核的菌株以外不显著，有时呈红至褐色，无嗅，但有时很难闻，很多菌株，特别是在新分离的菌株中产生菌核，有时可控制菌落的外观，其形状、大小和色素均变化不一，以白色菌丝球的形式出现，常表现为球形至近球形，并逐渐由白色通过暗红至褐色到近似黑色的特征，一般直径为400-700um，很少超过lmm，但有些菌株一律较小，另一些菌株无较深的色素，还有些菌株向垂直方向延长或不限定的顶部生长。

【分生抱子头】典型放射状，劈裂成几个不明显的圆柱状，直径很少超过500一600um,大部分菌株为300-400um，较小的头偶尔呈圆柱状300×50um。

【分生孢子梗】壁厚，无色，极粗糙，通常长度小于lmm，但偶尔有的菌株（特别是在实验室长期保存的培养物）可达2.0--2.5mm，顶囊下面的分生抱子梗的直径为10-20um。

【顶囊】早期稍长，晚期变成近似球形或球形，直径的变化从10一65um，但大部分菌株一般为25一45um。

【小梗】在正常的顶囊上不是单层就是双层，在一个头上很少见发生两种情况，梗基通常为（6.0一10.0)um×(4. 0一 5.5)um，但有时长达15um或16um，并且偶尔见到直径膨胀到8.Oum或9.Oum,小梗为（6.5一10.0)um×(3.0一5.0)um；单层小梗大小不一，(6.5一14.0)um×(3.0一5.5)um，一律在小顶囊上产生，形成分生抱子的顶端通常呈瓶状。

【分生抱子】典型呈球形到近似球形，具显著的小刺，直径变化不定，3.0一6.Oum，但大部分为3.5-4.5um，初形成时有时呈椭圆形，偶尔见到继续为椭圆形，此时测量，为(4.5-5.5)um×(3.5一4.5)um。

本菌是重要的储藏霉菌，能分泌对种子有毒害作用的物质，使种子很快丧失发芽力。大多数菌株寄生谷物后，对人、家畜和家禽是无毒，产毒的只占少数。产毒的菌株寄生于玉米、大米、花生米等粮食种子后，能产生黄曲霉毒素，可引起幼禽（雏鸭、小火鸡）、幼畜（小猪、小牛犊）的肝癌以致很快死亡。

B、寄生曲霉(A. parasitius Speare)

［菌落］在察氏琼脂培养基上生长良好，于24-26℃培养8-10d直径可达2.5-4.Ocm，由致密的基层菌丝组成，有些菌株具有较宽的、白色的、几乎不形成孢子的边缘，另一些菌株则形成埋伏型和绒毛状的边缘，扁平或稍具放射沟，产生非常丰富的分生孢子头，其颜色根据菌株及其成熟程度的不同而变化，幼时从明显的亮黄色（近似蜡黄色），通过草绿色或杉绿色到暗黄绿色（近似常春藤绿色）老时到暗浊黄绿色；反面淡黄色到微淡褐色；渗出液很少；气味不明显。

［分生孢子头］很一致，呈疏松的放射状，直径可达400-500um。

【分生孢子梗】长度不一，从200um到很少见的1.Omm以上，大部分菌株的长度为300-700um，一般在400um以下，壁无色，有些菌株光滑或近似光滑，另一些菌株下面光滑，上面明显的粗糙。

【顶囊】从狭窄的基部（直径3um）逐渐扩大至10-12tum，并迅速形成近似球形到烧瓶形或乳钵形的顶囊，直径为20-35um。

【小梗】呈单层，7-9um×3.0-4.Oum，密集在顶囊的表面上，无色或呈淡黄绿色。

【分生孢子】呈球形，具粗疏的小刺，直径为3.5-5.5um，亮黄绿色。

无菌核和闭囊壳。

本菌系属黄曲霉菌群的菌种。本菌寄生谷物后，绝大部分菌株均能产生黄曲霉毒素铁均能产生黄曲霉毒素。

C、杂色曲霉[Aspergillus versicolor (Vuill) Tiraboscli]

【菌落】在察氏琼脂培养基上生长较慢，于24-26℃培养两周直径达2-3cm，有些菌株致密，具有丰富的由基质生出的分生孢子梗；另有些菌栋呈现显著的密集交织的气生菌丝，并生出或多或少丰富的短分支样的分生孢子梗；还有些菌株两种生长类型结合发育，菌落中心隆起或呈纽扣状，起初为白色，通过黄色、橘黄色至黄色、黄褐色到黄绿色，例如青豆绿色则根据菌株和孢子形成的量而定，偶尔呈现完全无绿色的肉色到粉红色；渗出液无到丰富，由清晰到暗葡萄酒红色；反面和基质无色或近乎无色，有些菌株通过黄色到橘黄色，然后呈玫瑰色到红色或紫红色。

【分生孢子头】呈粗糙的半球形，放射状，直径100-125um。

【分生孢子梗】无色或在具有强烈色素的菌株中带黄色，壁厚，光滑，500um甚至700um×5um或接近顶囊处约l0um。

【顶囊】直径12-16um，较大者罕见，可育区为半球形或半椭圆形。分生孢子梗顶端几乎形成稍微扩大的漏斗状。

【小梗】双层，梗基一般为（5.5-8.0)um×(3.0-4)um，偶尔较小，小梗（5.0-7.5)um×(2.0一2.5)um。

顶囊和小梗在富有色素的菌株中，可能具有颜色。

【分生孢子】球形，具有粗疏的到细密的小刺，大部分2-3um，很少为3.5um，通常组成疏松的放射状的链。

【壳细胞】产生时，为构巢曲霉型。

闭囊壳未发现。

菌核未发现。

本菌主要在含水量15％左右的贮粮上活动为害，被侵染的大米变为白垩色，其他谷物种子，如玉米和小麦亦能寄生，可产生杂色曲霉素，能引起动物肝癌。

二、青霉属

此菌属与曲霉属接近，种类甚多，分布亦广。许多菌株均能引起食品的霉坏，特别是对贮粮和曲霉一样，均能导致粮食发热霉变，也有不少菌种能够产生强烈的毒素而使粮食带毒。

Raper和Thom将青霉属分为4个大群、41个系、127个种和4个变种。在基质中产生毒素的菌株很多，仅就主要的一些菌种分别加以描述，以便鉴定时作为参考。

鉴定青霉要比曲霉困难一些。由于青霉的菌落颜色比较单一，多为灰绿色，而陈旧的培养物又会改变，也可随培养条件的不同而变化。在试验室中即使在一般相同的条件下，某些菌株在相继的培养中也会发生变异，培养和鉴定的程序均与曲霉属相同。

A、黄绿青霉(Penicillium citreo-viride Biourge)

【菌落】在察氏琼脂培养基上生长局限，于室温培养12-14d，直径可达2.0-3.Ocm,呈明显的皱褶和纽扣状，有的菌落中心部位隆起，也有的中心凹陷，由柔韧的菌丝组成绒毡状，厚度达100-200um或以上，但到边缘则逐渐变薄，呈一种纤维状边缘。大部分菌株呈明显的柠檬黄色至黄绿色。培养2周以上才呈现很少的分生孢子发育，有些菌株孢子形成则不太缓慢，在10-14d即变成浊灰色，表面呈现绒状或具很少的絮状，营养菌丝细弱呈黄色。渗出液有些菌株不产生；有些菌株很少，呈淡柠檬色，气味小，发霉味。反面和琼脂在生长期至亮黄色，有些菌株在老时变得较暗。

【分生孢子梗】主要从匍匐的和分支的菌丝上产生，壁光滑，大部分为（50-100)um×(1.6-2.2)um，但有时从基质上产生，较长，可达150um。

【帚状枝】大部分为简单的单轮生，偶尔呈现主轴延长或从较低的节上生出1个或2个分支，产生次级小梗轮生体，产生的分生孢子链长达50um以上，疏松并列或略分散，不粘连成坚实的柱状。

【小梗】8-12个密集簇生，大部分为（(9-12)um×(2.2-2.8)um，均具有相当长的梗颈。

【分生孢子】球形，2.2-2.8um，壁薄，光滑或近乎光滑，粘连成明显的链。

此菌分布广，能在较低的温度和营养条件下正常发育，常可从土壤、病变米和其他物质中分离出来。有些菌株能产生毒素，日本过去曾从病变米上发现，并定名为毒青霉，后经分类学研究，已改称黄绿青霉。该菌所致的病变米为“黄变米”，米粒含水量在15％即能发生，该菌从米的损伤部和胚部开始寄生，被侵染的糙米和白米初呈淡黄色，后形成黄色斑点。病米具有特殊的臭气，在紫外线照射下能产生黄色荧光。所产生的毒素为黄绿青霉素，能引起动物的肝肿瘤、中枢神经麻痹和贫血症，用酒精从病米中提取的粗毒素具有黄色荧光，以此毒素0.05-0.15mL注射或混喂小白鼠，均能导致死亡。

B、桔青霉(Penicillium citrinum Thom )

【菌落】在察氏琼脂培养基上生长局限，于24-25℃培养10-14d，直径一般为2.0一2.5cm。具有典型的放射状皱纹，通常很明显，大部分菌株为绒状，有些菌株稍带絮状，还有些菌株质地交织致密几乎呈革状。分生孢子的产生，在不同菌株中从少到多，在某种程度上要看在培养皿中的菌落数目的多少孢子区初期旱a绿色，近似白菜绿色，成熟期则形成艾绿至白荷花绿色（黄至绿色），在晚期最后呈现鼠灰至深橄榄灰色。分生孢子的产生通常较晚(8-10d以后），而且在整个菌落中都不一致，一般在边缘到接近边缘区很厚。渗出液丰富，常以淡黄色至稻草色不同大小的水珠形式产生；有些菌株有明显的蘑菇气味，有些菌株则不显著。反面通常呈黄色至橘黄色，琼脂变成类似的颜色，往往稍带点淡粉红色。

【分生孢子梗】大部分从基质上发生，或从较厚的菌落中心部位的气生菌丝上发生，或在絮状菌株中发生，大部分长为50-200um，直径为2.2-3.um，通常不分支，但偶尔产生一个或多个长25-35um的分支。所有的分生袍子梗壁均光滑。

【帚状枝】由3-4个顶端的枝群组成，或偶尔更多一些 。

【梗基】略分散，大小为（12一20) um×(2.2-3.0)um（顶部膨大至4.Oum或5.Oum)。

【小梗】每个梗基支持一个由6-10个略微拥挤并列的小梗组成的小梗丛，每个小梗为(8.0-11.0)um×(2.0-2.8)um，并且产生并列的分生孢子链，呈很明显的圆柱状，长达100一150um。

【分生孢子】球形至近球形，大部分为2.5一3.Oum，但一般是在2.2 - 3.2um的范围，壁光滑或近似光滑，然而往往在检查时在气泡里可见有小颗粒。

桔青霉是常见的腐生菌，能引起多种有机物质霉腐，接近干生性。孢子萌芽的最低相对湿度为80%，最高发育温度为37℃，粮食上经常可以分离出来，特别是世界各国所产的大米上均有不同程度的感染，在大米上发展时能引起黄色的病变并使大米具有毒性，这种米日本称之为“泰国黄变米”。

被害大米的米粒从淡黄色到黄色。病况发展后，在黄色米粒上出现淡青色的菌丛。病米在紫外线照射下能产生黄色荧光，用该菌人工接种制成的病米来饲喂小白鼠，80d左右即全部发生肾脏中毒死亡，此毒素即为桔青霉素。

C、镰刀菌属

镰刀菌属的霉菌种类多，分布广，且多为腐生，也有不少菌种为重要的粮食作物和其他植物的病害菌。目前已发现能在粮食和食品中主要产生毒素的菌株有禾谷镰刀菌（其有性世代称为玉米赤霉菌）、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌、雪腐镰刀菌、茄病镰刀菌和申抱镰刀菌等，所产生的毒素也有使动物中毒的报道。

镰刀菌属不仅种类繁多，而且大部分菌种的培养性状很难保持稳定，初分离时有时只产生菌丝体，常常很难诱导产生正常的分生孢’子形态，在鉴定工作中会带来很大困难，因此，首先选择适合产生各种性状的培养基是非常重要的。

(1)接种和培养在鉴定镰刀菌工作中，可选用几种标准培养基进行接种和培养，一般培养温度为26 ℃。现将这些培养基的名称和用途分述如下。

①马铃薯块斜面：在这种培养基上，较容易地产生分生抱子座和黏性分生抱子团。

②燕麦琼脂培养基：这种培养基可用作描述色素及产生分生孢子座。

③马铃薯2%葡萄糖琼脂培养基：这种培养基可用于观察大分生孢子、菌核、厚垣抱子以及色素。

④马铃薯5％葡萄德琼脂培养基：用途与第三种培养基相同。

⑤大米培养基：这种培养基主要用于描述色素。

⑥苜蓿茎：这种培养基主要供产生分生抱子座用。

⑦三叶草茎；用途与第六种培养基相同。

⑧槐枝：用途同苜蓿茎。

⑨玉米琼脂培养基：这种培养基用于产生分生抱子座及描述色素。

⑩小麦煎汁加2％食盐：诱导禾谷镰刀菌的大分生抱子用。

(2）测量和描绘分生抱子的标准日期鉴定镰刀菌菌种，除了确定标准培养基以外，还需要确定测量分生抱子的标准日期。镰刀菌分生孢子的形态、大小、分类及横隔数目在鉴定中居很重要的地位。由于培养的时间不同，分生抱子的长度与宽度也会发生差异。一般说来，大多数镰刀菌菌种，在马铃薯葡萄糖琼脂上生长到第15天都能形成发育正常的分生孢子的子实体，如在这个时期内末长出子实体，以后每隔15d再检查一次，即第30天、第45天等。在此期间观察分生抱子的大小是比较一致的，测量各种不同类型的分生孢子时，通常用测微计分别测量50-100个。

(3)观察色素的标准日期在培养基上镰刀菌所产生的色素性状，在分类鉴定中也具有很大意义，应和测量分生孢子一样，需要确定一个描述色素的标准日期，镰刀菌培养的颜色深度与培养的生长程度有很大关系，一般说来，色素在第30天表现得最清楚。色素是种、变种及型的鉴别性状，在描述色素时，最好能对照标准色谱加以描述。通常观察产生的色素均以大米培养基、马铃薯块培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基的颜色变化为基础，一般描述其初期菌丝体和后期菌丝体出现的颜色以及菌核的颜色。

a、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw )

禾谷镰刀菌属于色变组（Discolor）中的一个种。

【大分生孢子】生长于分生抱子座和黏分生抱子团内，纺锤或镰刀形，椭圆形弯曲，顶端细胞均匀地逐渐变细，基部有明显足细胞，典型的具5隔，很少具3隔和更多的隔。

成堆时微白至玫瑰色，赭至玫瑰色，金黄色至黄色，洋红至紫红色。

在马铃薯葡萄糖球脂培养基上第15天大小为，3隔的41um X 4.3um。 5隔的51um×4.9um［(41一73um×(4一5.9)um]。7隔的73um×5.4um。

【厚垣抱子】间生，不多或无。

【菌核】呈各种深浅不一的紫红色、暗紫红色、鲜明玫瑰色或无色。

【颜色】在大米培养基上于座呈典型的黄色、暗奶油色、黄至橄榄色、赭至橄榄色。后期菌丝体为黄色或为子座的各种色泽，以及呈各种紫红色和玫瑰色；在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，气生菌丝体生长良好，棉絮状至丝状，白色或紫红色。基质亦呈紫红色。

该菌主要寄生在禾本科植物上，普通侵染大麦、稻谷、黑麦、小麦、玉米及其他植物的种子、穗、茎和根上。产生的毒素为玉米赤霉烯酮、雪腐镰刀菌烯醇和镰刀菌烯酮-X。

b、梨孢镰刀菌［Fusarium poae (Peck) Wr. ]

本菌系属于枝抱组（Sporotrichella）中的菌种。

【分生抱子】生长在气生菌丝中的小分生袍子，绝大多数为梨形和柠檬形。在马铃薯葡萄糖琼脂第15天其大小为：0隔的8.5um × 5.4um［(5一12) um×(3-8)um]。1隔的13um×5.8um［(9一20um×(3.5一9)um]。

【大分生抱子】纺锤形拟椭圆形弯曲，大小为：3隔的27um× 4.3um［(18一 35)um×(3.5一5.0)um]。

【厚垣抱子】绝大多数间生，成串及结节状。

【菌核】无。

【颜色】在大米培养基上子座呈典型的黄至橄榄色，带紫色色泽，在马铃薯琼脂上气生菌丝为白色或玫瑰色。

此菌主要寄生于燕麦、小麦和玉米的种子上，能产生T-2毒素、丁烯酸内酯和新茄病镰刀菌烯醇。