1．多管发酵法（总大肠菌群、粪大肠菌群）

(1）原理

多管发酵法是以最可能数（Most probable number, MPN）来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

(2）培养基和试剂

本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。

单倍乳糖蛋白陈培养液：

成分：蛋白胨l0g

牛肉浸膏3g

乳糖5g

氯化钠5g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液l ml

蒸馏水1 000 ml

制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于 1 000 ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1 ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸气灭菌器中，在115℃灭菌20 min，贮存于暗处备用。

三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白陈培养液，制法同上。

EC培养液：

成分：胰胨20 g

乳糖5g

胆盐三号1.5 g

磷酸氢二钾（K₂HP0₄) 4 g

磷酸二氢钾（KH₂PO₄) 1.5 g

氯化钠5g

蒸馏水1 000 ml

制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20 min。灭菌后pH应为6.9。

培养基的存放：在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。

（3）步骤

水样接种量：将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。

相对未受污染的水样接种量为10 ml, 1 ml, 0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度接种1 ml, 0.1 ml, 0.01 ml或0.1 ml, 0.01 ml, 0.001 ml等。

如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5 ml；如接种量为1 ml或少于1 ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白陈培养液10 ml中。

初发酵试验：将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在（37±0.5)℃下培养（24±2) h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。

复发酵试验：轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养（24±2) h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30 min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。

结果的计算：根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从MPN表中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100 ml 2份、10 ml 10份、总量300 ml时，查MPN可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10 ml水样、5份1 ml水样、5份0.1 ml水样时，求得MPN指数，MPN值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。