无菌技术指防止细菌等微生物进入人体、培养物或其他物品的操作技术，因此无菌技术在细胞培养中显得尤为重要，由于组织细胞离体后缺乏抗感染能力，故在体外培养细胞能否获得成功，其首要的决定条件就是无菌技术。无菌技术包括培养前的准备工作，如要确保实验室洁净、消毒，培养所用物品和培养用液是无菌的，要经过检菌证明无菌生长，要保证在细胞培养全过程的一切操作，包括取材、细胞制备、培养、换液和传代，细胞冻存、复苏和运输等，均符合无菌技术的要求，要努力做到最大限度的无菌。

1．操作野的消毒工作面要先用0.3％苯扎溴铵或75％乙醇擦拭一遍，然后主要用紫外线灯消毒，效果较好。细胞培养操作前，操作室、无菌工作台等需用紫外线消毒30～60分钟。用紫外线灯照射期间，在台面上勿置培养细胞和培养液等物，以免受射线影响。紫外线穿透力差，只有表面杀菌作用。因此，工作野用品过多或重叠放置，能降低紫外线的消毒效果。

2．洗手和着无菌衣帽、口罩原则上和外科手术相同。在进行细胞培养工作前要用75％乙醇或用0.2％苯扎溴铵擦手消毒，在无菌室内工作时需着消毒衣帽和口罩等；利用超净工作台做细胞培养时，仅戴口罩和着一般工作衣即可。

3．火焰灭菌在进行细胞培养时，首先要点燃乙醇灯或煤气灯。在细胞培养的操作过程中，吸管、毛滴管等要上下旋转，快速通过火焰，在连接吸管与吸球、打开或关闭瓶口等时，都要在火焰近处进行并要经过快速火焰烧灼。要注意金属器械不能在火焰中烧灼太长时间，以防退火。烧过的金属器械要待冷后才能接触组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再经火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会将有害物带入培养液中。

4．无菌操作进行细胞培养时，操作动作要准确敏捷，但不必太快，以免引起空气流动过大，增加污染机会。为拿取方便和避免触碰，工作台面上的用品要合理摆放，原则上为右手使用方便的用品放在右边，左手用品放在左侧。操作时，要保持一定的顺序性，组织或细胞未做处理之前，勿过早暴露在空气中。培养液在未用前，不要过早开瓶，用过之后如不再重复使用、应立即封闭瓶口。培养用瓶开瓶后皆应保持45。倾斜或平放，以防污染物直接落进瓶口。吸取营养液、BSS、细胞悬液及其他各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。操作中不要面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把口腔中的微生物带入工作台面发生污染。细胞培养工作结束后，要及时整理操作台面，扔掉废弃物品。然后用紫外线照射至少30分钟。在使用放射性核素时应格外注意防止放射性污染。