扫描电子显微镜的特点是能观察物质表面的立体微细形貌，它利用电子束与一个阴极射线管的电子束同步扫描标本，使之形成一个具有三维结构的图像，此图像可以显示细胞的表面结构，这是透射电镜所做不到的。另外，扫描电镜的标本的制作简便、周期短、不需切片、染色。通常，为获得维持材料原形不变的细胞结构，需对样品进行干燥，此外，为防止电子在标本上聚焦，还需用镀金方法使标本导电。

【原理】

自电子枪阴极发射出来的电子受到5～30kV的电压加速，经两个聚光镜和物镜组成的电子光学系统形成极细的电子束并聚焦于样品表面，引起二次电子的发射，而二次电子的发射量与样品的表面形貌有关。使二次电子加速至10kV左右并射到由闪烁塑料光导管、光电倍增管等组成的探测器上，再经视频放大后调制显像管的亮度。当人射电子束在扫描线圈的作用下，在标本表面逐点逐行扫描时，由于显像管的偏转线圈电流与扫描线圈中的电流同步，所以显像管荧光屏上任一点的亮度便于标本表面上相应点发出的二次电子数相应，结果在荧光屏上形成标本的表面图像。图像可直接在荧光屏上观察，亦可照相记录。

【材料】

1．同一般扫描电镜样品制备所需器材与制剂。

2．待观察的培养细胞：贴壁细胞经消化制成细胞悬液，或悬浮培养细胞，细胞量约10⁶～10⁷个细胞。

【方法】

1．取材与清洗在直径35 mm培养皿或细胞培养瓶内放置适当大小（6 mm×22mm）的盖玻片，接种2m1细胞悬液，约10⁴～10⁵个细胞，放入C0₂孵箱培养一段时间，待细胞单层汇合成片，取出细胞铺片，浸入PBS液中漂洗盖玻片上的细胞表面。

2．固定将细胞铺片放入小玻璃瓶中，加4℃预冷的2.5％的戊二醛，细胞在4℃下固定2小时或过夜。然后吸出固定液，用PBS液浸洗2次，每次15分钟。再于4℃下用预冷的1%饿酸固定1～2小时，吸出固定液，用PBS液浸洗2次，每次15分钟。

3．脱水为防止细胞在干燥时变形，常用系列梯度脱水剂（乙醇、丙酮或醋酸异戊酯 )进行梯度脱水。

(1）乙醇脱水法：配制30%,50%,70%,80%,90%,95％和100％乙醇，样品从30％乙醇逐步移至100％乙醇中进行脱水，每种浓度乙醇通过2次，每次15分钟。

(2)丙酮脱水法：配制30%,50%,70%,90%,100％丙酮，样品从30％丙酮逐步移至100％丙酮，每次脱水15分钟～2小时。

(3)醋酸异戊酯脱水法：配制30%,50%,70%,90%,100％的醋酸异戊醋的丙酮脱水剂，样品从30％的醋酸异戊酯的脱水剂开始，逐步移至100%醋酸异戊酯的脱水剂，每次脱水15分钟。

4．干燥脱水后的细胞仍需进一步干燥才能进行样本的导电处理。常用的干燥方法有临界点干燥法、冷冻干燥法和乙腈真空干燥法，后者较为常用。

(1)乙腈真空干燥法：样品处理按上述方法取材、固定和脱水，然后再经乙腈置换和真空干燥处理即可。

1)乙腈置换：将脱水的细胞铺片浸入50％的乙腈水溶液中，然后依次更换70%,80%,90%,95％和100％的乙腈溶液，每次浸泡15～20分钟，最后再换100％的乙腈溶液。

2）真空干燥：将乙腈置换后的细胞铺片连同小瓶一起放到真空镀膜台的钟罩内，抽低真空，一般需30～50分钟。

3)取出样品：样品干燥后，待其温度升至室温时再放气，取出样品。

(2)冷冻干燥法：将已固定与丙酮脱水的标品放至5cm×5cm的样品杯中，置液氮中冷冻。再将放有样品的样品杯放于真空镀膜台的钟罩内抽真空，使固化液氮和细胞中的丙酮升华，得到干燥的样品。此法简便易行，不要求特殊设备，也不会出现由于表面张力的牵拉而引起的样品损伤，但因急速冻结易产生水晶会导致细胞膨胀等损伤。

(3)临界点干燥法：将浸入醋酸异戊酯的样品取出放入特制的标本盒内，送入临界点干燥仪的封闭标本室内。将此室充以液态C0₂（临界温度为31.4℃、临界压力为7384.770kPa)。然后加温到15℃，使液态C0₂与样品中的醋酸异戊酯置换15分钟。待升温至40℃时，标本室约为10 132.5kPa，放置5分钟。然后打开泄气阀是缓缓放出，自盒中取出干燥后的标本。

5.喷镀将干燥后的标本用导电胶粘在样品托上，待导电胶干燥后，立即将样品托上的标本置于真空喷镀仪内，先喷一层10nm厚的碳膜，然后再喷镀一层10～20nm厚的金或铂膜。镀膜后的标本可在扫描电子显微镜下观察，或保存在干燥器内。

【结果】

扫描电镜观察：先打开电源，抽真空，待达到设定的真空度后，放入样品，进行加速高压选择、观察区域选择、放大倍数选择、倾斜度选择、工作距离选择、图像聚焦、观察及拍照记录。观察完成后，取出样品，关机。

【注意事项】

1．标本应预先充分固定与脱水，并确定观察面；

2．保证标本室及相关管道的清洁，以防止污染标本；

3．封闭标本室及C0₂瓶内的压力非常高，有关部位的螺旋应拧紧，以防发生意外；

4．排气速度不宜过快，温度应控制于45～50℃，否则标本可能膨胀；

5．封闭标本室内的C0₂液体必须浸没标本，否则不能做到临界点干燥。