支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。支原体是一种介于细菌和病毒之间的能独立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。支原体污染后培养基一般不发生混浊，细胞形态无明显变化，但实际上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发现，因此对支原体的污染必须引起足够的重视，应严加防范。支原体污染常用的检查方法如下。

1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观察。如有支原体污染，镜下可见暗色微小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。要注意支原体与细胞破碎后溢出的内容物如线粒体等相区别。电镜检测：用一般染色方法难以确定时，可用电镜检查。详见电子显微镜技术一节。

2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观察，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。

【材料】

(1)待检疑有支原体污染的培养物；

(2）检测用试剂：低张处理液（0.45%枸橼酸钠），Carnoy固定液（配方：60ml纯乙醇加30ml氯仿和10m1冰醋酸）,2％的醋酸地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml冰醋酸加蒸馏水至100m1 )。

【方法】

(1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。

(2）低张处理：用新鲜配制的0.45％枸橼酸钠溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。

(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。

(4）染色：将晾干的涂片用2％的醋酸地衣红染5分钟。用PBS液洗片，晾干后镜检。

【结果】

显微镜观察：支原体和细胞被染成紫红色（如染色过深可用75％乙醇脱色）。镜下可见位于细胞表面或散在细胞之间有染成紫红色的支原体。

3．支原体DNA荧光染色法荧光染料Hoechst 33258能与DNA特异结合，支原体内含有DNA，故能与这种染料结合而着色。

【材料】

(1)待检疑有支原体污染的（vero细胞在盖玻片上的单层）培养物；

(2）染色用试剂：荧光染料Hoechst 33258（含0.1 mg/ml二苯肼咪胺、Hoechst 33258，用不含酚磺酞的Hanks液或PBS缓冲液配制，浓度为50mg/ml)；固定液（醋酸：甲醇为1：3)；pH 5.5的磷酸缓冲液。

(3)荧光显微镜等。

【方法】

(1)标本涂片：从培养瓶中取出vero单层细胞的盖片，放入平皿中，用不含酚磺酞的Hanks液漂洗。

(2）固定：以固定液（醋酸：甲醇为1:3)固定单层细胞3分钟，换新鲜固定液再固定3分钟。

(3)染色：吸出固定液，晾干载玻片，浸入2ml Hoechst 33258染液中，室温避光孵育10分钟。

(4)观察：取出细胞盖片，滴pH 5.5的磷酸缓冲液数滴，再覆以盖片，置荧光显微镜观察；荧光显微镜下可见支原体呈亮绿色小点，散在细胞周围或附于细胞表面。

4．支原体的分离培养

【材料】

(1)待检疑有支原体污染的培养物；

(2）Hayflick琼脂培养基成分：

成分I：牛心浸出液1000m1,氯化钠5g，蛋白胨l0g，琼脂粉14g。

成分Ⅱ：无菌小牛血清或马血清（不灭活）20ml,25％鲜酵母浸出液l0ml,l%醋酸铊2.5 ml、青霉素（20万单位／ml) 0.5 ml,20％无菌葡萄糖溶液5m1。

【方法】

(1)制备Hayflick琼脂培养基：①牛心浸出液制备：将牛心400g绞碎，浸于1000m1水中3小时，煮沸20分钟，待冷却后置于4℃过夜，去除浸出液表面的脂肪，过滤，补足水分至l000ml。加入蛋白胨、氯化钠。加温溶解后调节pH至8.4～9.0，流通蒸气加热2小时，使磷酸盐沉淀。用滤纸过滤后再调pH至7.8。加琼脂粉14g后溶解，然后121.3℃高压灭菌15分钟。②待上述培养基冷却至80℃加成分Ⅱ，混合后倾注平皿。

(2）待检疑有支原体污染的培养物标本接种上述培养基后，置37 ℃孵箱培养，连续观察一周。

【结果】

支原体接种Hayflick琼脂培养基，置37℃孵箱培养。支原体生长，集落微小，需仔细观察，必要时需借助放大镜观察，典型者为油煎蛋样菌落。进一步可根据发酵葡萄糖、利用精氨酸、水解尿素等生化特性进行初步鉴定。

5．支原体培养一体化试剂盒法

【材料】

(1)待检疑有支原体污染的培养物，或上述方法分离的支原体菌落；

(2）支原体培养一体化试剂盒、液体石蜡、无菌加样枪等。

【方法】

严格按照试剂盒操作说明书进行操作。

(1)取出培养基基质瓶、固体瓶和12孔鉴定药敏板，使其恢复至室温；

(2）直接将疑有支原体污染的培养物或分离的支原体菌落接种于已恢复室温的基质瓶内，称其为B液；

(3)将接种好标本的B液全部倒入固体瓶内，称其为C液；

(4)打开12孔鉴定药敏板上的盖子，用无菌加样枪分别吸取100m1 C液至12孔鉴定药敏板的每一孔；

(5）在每一孔正上方准确的加入2滴液体石蜡，盖好瓶盖。反应板在35℃孵箱内培养12小时，开始观察结果。

【结果】

(1)培养基保持橙黄色不变为阴性，由橙黄色变为红色且液体清亮为阳性；

(2）终止在24小时内报告解ww原体（Ureaplasma urealyticum, Uu )，终止在48小时内报告人型支原体（Mycoplasma hominis, Mh )。以免假阳性结果出现。

(3）药敏孔由橙黄色变为红色表示支原体对该药耐药；保持橙黄色不变表示支原体对该药敏感。显示支原体对林可霉素、红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、米诺环素、多西环素、氧氟沙星和诺氟沙星等8种抗菌药物的敏感性和耐药性。

(4)根据药敏试验结果，选择对该支原体敏感的抗生素处理污染的细胞。

【注意事项】

如果由橙黄色变为红色且液体混浊，视为假阳性，可能是其他细菌或真菌感染。

6.³ H-胸腺嘧啶掺入法取待检培养液，先以800r/min离心6分钟，取上清液，再以3000r/min离心10分钟，弃上清液，取0.l ml沉淀液加入96孔微孔培养板中，再加入等量培养液。置37℃孵育48分钟，每孔再加入0.05 ml含1mCi³H-胸腺嘧啶的RPMI 1640培养液，置37℃孵育18分钟后，用细胞收集器收集待检标本，用液闪测定掺入支原体中放射性核素的量。一般本底为100～200cpm，如掺入量大于1000cpm，可能为支原体污染。必要时可做对照试验。

7．聚合酶链反应方法利用已设计好的对支原体16SrRNA基因或16-23 SrRNA基因间隔区特异的引物检测待检样本中极小量的支原体DNA，其敏感性比支原体培养方法高1000倍，是检测支原体污染的快速、可靠的方法。

8．免疫学方法利用支原体的单克隆抗体，和荧光／酶标记的抗抗体检测支原体的特异性抗原，阳性者为支原体污染，此法快速、有特异性。