一、细胞的冻存

细胞冻存是指将细胞混悬于冻存保护液中以一定的冷冻速度将细胞悬液降至-70℃以下，常于-196℃的液氮罐中长期保存。细胞冻存可保持传代细胞某些性质的相对稳定，同时也减少了长期传代中会受到支原体等微生物污染的机会。

【原理】向将要冻存的细胞中加入冻存保存剂（冻存液），冻存液可分为渗透性和非渗透性两类，前者是一些小分子物质，可渗透到细胞内，主要包括甘油、二甲基亚砜(DMSO),乙二醇、丙二醇和乙酞胺等；后者一般是一些大分子物质，不能渗透到细胞内，主要包括聚乙烯毗咯烷酮( polyvinylpyrrolidone, PVP )、聚乙二醇、蔗糖、清蛋白等。冻存液可降低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过程中的损伤程度。细胞可在-70℃以下冰箱或液氮罐中长期保存。

【材料】

1．冻存保护液一般是7份培养液、2份胎牛血清和1份DMSO配成；或以小牛血清和DMSO按9:1的比例混合而成，冻存液最好是现配现用，在4℃下预冷备用。

2．设备与器具普通冰箱、低温冰箱（-80～-70℃)、液氮罐、电子计算机程控降温仪，冻存管（容积为0.5～1.5ml)等。

3．消化液视冻存细胞的特性要求准备消化液，一般为0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。

4．待冻存细胞。

【方法】

1．选用对数生长期细胞，在冻存细胞前一天换液1次。

2．贴壁细胞需常规方法将细胞消化下来，制备成单细胞悬液（悬浮培养细胞则省略消化过程），收集单细胞悬液用1000r/min，离心5分钟，弃上清液，用冻存液混悬沉淀细胞，并调整细胞浓度至（1～10)×10⁶/ml。

3．将细胞悬液分装入冻存管内（0.5～1.5m1/管），扭紧管盖，注明细胞名称、培养液名称和冻存日期。

4．一般冻存法

(1)将上述冻存管先在4℃下放置30分钟，然后将冻存管放入泡沫塑料小盒内，立即移入-80℃以下的超低温冰箱内保存。-80℃可保存细胞2～3个月。

(2）将冻存管在4℃下放置30分钟，然后将冻存管放入泡沫塑料小盒内立即移入-80℃超低温冰箱内过夜；如果没有泡沫塑料小盒，可将冻存管移入-20℃冰箱内放置1小时，再移至-80℃超低温冰箱内过夜，次日放入液氮罐中长期保存。

(3)将冻存管在4℃下放置30分钟后，可先将冻存细胞放-20℃冰箱内30分钟，然后将细胞转入液氮罐内的瓶口处放置2小时，再匀速下降至液氮中保存。

5．电子计算机程控降温仪法冻存后为保持细胞最大存活率，用程控降温仪根据不同细胞采用不同的降温程序连续降温，使用方便、准确、可靠。标准的降温速度为1～2℃/min,当温度达-25℃时降温速度可加至5～10℃/min(降温初始的速度不能超过1090 /min )，降温至-100℃时则可迅速浸入液氮中保存。

【结果】

细胞不同，冻存效果不同。通常细胞存活率可达90％以上。在-80℃超低温冰箱内细胞可保存数月；在液氮中原则上细胞可贮存多年。但为妥善起见，冻存1年后应予以复苏一次，然后再继续冻存。

【注意事项】

1．待冻存的细胞应具有较高的活力，即处于对数生长期的细胞。

2．细胞不同，冻存效果不同，应选择合适的冻存速度和冻存温度，以免在冻存过程中损伤细胞。

3．常温下DMSO对细胞有毒副作用，故冻存液应在4℃条件下放置40～60分钟后使用。配制冻存液时要注意自我防护。

4．细胞冻存管投入液氮或从液氮中取出时都要小心，以免液氮伤及人体，尤其在液氮运输和往罐中补加新的液氮时，最好穿戴防冻手套、护眼镜、工作服和防冻鞋等。