贴壁细胞在M期进行有丝分裂时会失去贴壁性，常用振摇脱落法使细胞同步化在M期。呈单层生长的细胞从G2期进入M期时，细胞逐渐隆起，继而成为圆形。此时，细胞与瓶壁表面的黏附力大为降低，极易从壁上分离下来。但由于M期细胞在整个细胞群中的比例不高，即使在处于指数生长期中的培养物，M期细胞也仅占1％～3％。要想从培养物中分离处于M期的细胞，须采用一些其他的方法来增加M期细胞的比例，最常用的是秋水仙素阻抑法。秋水仙素能破坏细胞中的微管形成，阻抑有丝分裂，从而将细胞阻滞在中期。

1．振摇脱落法（适用于贴壁细胞）

【材料】

（1)培养细胞：贴壁单层细胞；

(2)试剂：0.1％胰蛋白酶消化液，无血清培养液与完全培养液、Giemsa染液；

(3)器具：培养瓶（162cm²) ，C0₂培养箱、离心机、显微镜、流式细胞仪。

【方法】

(1)传代培养：呈对数生长期的贴壁单层细胞，70％～80％的细胞汇合时，去除原培养液，用无血清培养液洗细胞1次，加0.1%胰蛋白酶3 ml，盖没瓶底细胞，于37℃消化5分钟，同时轻叩培养瓶，使松动的处于M期的圆形细胞脱落下来，加入20ml完全培养液，离心（1500r/min,5分钟）收集细胞。

(2)用完全培养液将收集的细胞计数并稀释至2.5×10⁵个／ml，取20～40m1细胞悬液接种到162cm²培养瓶中，置37℃培养6小时，此时活性细胞重新贴壁生长。轻轻摇动培养瓶，使培养液晃动，吸弃培养液以除去未贴壁的细胞，再用新鲜培养液洗细胞2次，最后加等量培养液继续培养10小时。

(3)收集M期细胞：在培养至10小时末，轻轻摇晃或在边台上轻叩培养瓶，使培养液冲刷细胞层，将圆形的M期细胞自瓶壁上脱落下来，然后吸出培养液以收集进入M期的分裂细胞，并将收集各瓶的培养液合并，离心（1500r/min, 5分钟）收集M期细胞。

(4)将细胞重悬浮并稀释成5×10⁵细胞／ml浓度，涂片并用Giemsa染色，用相差显微镜观察分裂细胞形态，或用流式细胞仪测知细胞周期位置。

【结果】

利用振摇脱落法将处于分裂期贴壁不牢的细胞收集在一起，在显微镜下可见分裂象特征，也可用流式细胞仪分析细胞周期处于M期。将这些分裂期的细胞收集后，再在瓶中于37℃培养2小时，即可获得较纯的G1期细胞。

2．秋水仙素阻抑法利用秋水仙素阻抑细胞分裂的作用，可获得大量M期细胞，然后分离培养，也可使细胞同步化生长。秋水仙素对染色体结构有一定影响，用量小时仍能恢复，但用量过大或作用时间过长会引起畸形分裂。因此，应用秋水仙素时要严格控制浓度和作用时间。

【材料】

（1)培养细胞：贴壁单层细胞；

(2）试剂：秋水仙素、Giemsa染液、无血清培养液与完全培养液；

(3)器具：培养瓶（162cm²)，C0₂培养箱、离心机、显微镜、流式细胞仪。

【方法】

(1)在培养瓶中备好指数生长期的细胞。

(2)在培养瓶内加入秋水仙素，浓度应相应加大至0.05～1 pg/ml，作用6小时后，倒掉含秋水仙素的培养液。加入新鲜培养液，手持培养瓶轻轻横向摇动使培养瓶壁上圆形的处于分裂期的细胞脱落下来。

(3）收集脱落细胞，以1500r/min离心5分钟后，吸除上清液。再加入培养液，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，并稀释成5×10⁵细胞/ml浓度。接种入培养瓶，置37℃培养箱中培养。细胞能同步进入细胞周期。细胞可用流式细胞仪分析，Giemsa染色和（或）相差显微镜检查。

【结果】

分离M期细胞的结果同振摇脱落法，用秋水仙素阻抑细胞分裂，可较前法增加M期细胞的比例。将有丝分裂摇落法得到的分裂期细胞，再在瓶中37℃培养箱中培养2小时，则可得到纯的G₁期细胞。分裂细胞将在瓶壁贴附，当它们进入M期时将铺展开来。