细胞融合（cell fusion）是两个或两个以上细胞融合并形成一个细胞的过程。在自然情况下，体内、外发生细胞融合的现象称为自然融合；体外培养的细胞可用人工方法诱导相同或不同细胞间发生融合，称为入工诱导融合。体外培养的单层贴壁细胞或悬浮细胞均可用来做细胞融合，成功融合的多见于单层贴壁细胞。细胞融合技术日臻完善，采用一些促融合处理措施，如聚乙二醇(PEG)、病毒攻击和电击融合法等。可大大提高产生融合细胞的数量，促细胞融合的关键是两种杂交前体细胞能直接接触，此外是细胞融合之后有必要采用生化手段，筛选分离出融合细胞。

细胞有两条合成核苷酸的途径，即从头合成与补救合成途径，培养细胞依靠其中任何一条途径均能成活。次黄漂吟一鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT）是负责补救途径中的一个基本步骤，催化焦磷酸、核糖和嘌呤基合成嘌呤单磷酸核苷酸；同样，胸苷激酶（TK）能将培养基中添加的胸苷转变为5’-单磷酸胸苷，作为合成胸苷脱氧核苷酸的来源，可以通过添加药物来阻断核苷酸从头合成途径，迫使细胞利用补救途径进行核苷酸的合成，从而筛选出杂交细胞，最常用于阻断嘌呤和嘧啶从头合成途径的药物是氨基蝶吟和甲氨蝶吟。当一方细胞是HPRT突变，另一方细胞是TK基因突变，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶吟或甲氨蝶岭、胸苷，在此条件下，杂交各方细胞（HPRT-/TK+或HPRT+/TK-）因各自嘌呤和嘧啶的从头合成途径被阻断，补救途径中的关键酶(HPRT或TK酶）缺失而不能成活；只有当细胞融合后包含了双方的基因组（HPRT+/TK+)，补救途径基因缺陷得以互补，融合细胞才能成活。实验中获得的融合细胞有同核融合细胞和异核融合细胞，基因型相同的细胞形成的融合细胞称同核融合细胞（homokaryon )；基因型不同的细胞形成的融合细胞称异核融合细胞（het-erokaryon )。将异核融合细胞筛选分离是至关重要的。

一、聚乙二醇诱导细胞融合法

聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG）是一种白色蜡状粉末，有轻微臭味，可溶于水，分子式为HOCH₂(CH₂OCH₂)nCH₂OH,PEG相对分子量在200～6000范围之内者均可用作细胞融合剂。一般以分子量为1000的效果较好。使用50% PEG溶液效果最好。PEG诱导细胞融合的机制不十分清楚，但目前认为，PEG能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，两细胞接口处在双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用下，细胞发生融合。

【材料】

1．细胞HGPRT-细胞、TK-细胞系

2. 50% PEG(W/V）溶液的制备

(1) PEG 50g溶解于盛有100m1蒸馏水的瓶中，115℃高压灭菌20分钟。

(2）待PEG冷却至50～60℃时，趁其尚未凝固加入不含血清的MEM培养液，转动混匀（如果配制过程中PEG凝固，可以在乙醇灯上稍烤使其溶解），根据溶液中培养基所含酚磺酞的颜色，用NaHC0₃调整pH至7.0～7.4。

3. HAT选择性培养基的制备

(1) 100×HT贮存液：取次黄嘌呤136mg和胸苷38mg，溶于100m1蒸馏水中，可加热（不能超过70℃）助溶，在100×HT贮存液中，次黄嘌呤的浓度为l0mmol/L，胸苷的浓度为1.6mmol/L。

(2) 100×A贮存液：称取1.76mg氨基蝶吟（aminopterin）溶于100m1蒸馏水中，加1.Omol/L NaOH 0.5m1助溶。然后用1 mol/L HCl将pH调回至7.0左右，注意勿调成酸性pH，因为氨基蝶吟对酸很敏感。100×A贮存液中氨基蝶吟的浓度为0.04mmo1/L。

(3）将100×HT和100×A两种贮存液各自过滤除菌，无菌分装每小瓶2ml，置-20℃冰箱贮存（可保存1年）。

(4）若为购买的100×HAT的HAT培养基（Sigma)，其终浓度如下：

次黄嘌呤（H)15ug/ml，氨基蝶吟（A)0.5ug/ml，胸苷（T)1Oug/ml。

4．其他试剂Earle盐溶液、Hanks液、生长培养液（通常为含10％胎牛血清的MEM培养液）,PBS液、二甲基亚砜、无血清的MEM培养液等。

5．仪器与器材恒温箱与水浴锅、普通冰箱、超低温冰箱、普通离心机、高速冷冻离心机、紫外线灯、普通显微镜、相差显微镜、超净工作台、C0₂培养箱、96孔和24孔培养板等。

【方法】

1．单层贴壁细胞的融合

(1)将杂交前体细胞以相同数量（5×100个／ml)接种（如果已知其中一种细胞生长速度快些，或有自体互融趋势的话，此种细胞比率可适当调低），以适当的培养基培养细胞，待细胞贴壁扩展至汇合成片（80％汇合率）的密度。

(2）吸干培养液，加2ml 50% PEG-1000，轻轻转动1分钟，让PEG黏稠液体覆盖所有细胞。

(3) PEG作用1分钟后，加入5 ml完全MEM培养液，以稀释PEG溶液，吸净稀释的PEG溶液，再用5ml MEM培养液洗涤被PEG作用的细胞2次。

(4)吸净洗液，加5 ml新MEM培养液，置37℃,5% CO₂的孵箱培养过夜。

(5)融合反应在24～48小时后，使用选择性培养基，先吸去培养液，加入2m1胰酶消化液处理细胞，待细胞消化后吸除胰酶消化液，用HAT选择性培养剔除HPRT和TK缺陷细胞。去上清液，用补加1×HT和1×A的完全培养液重新悬浮细胞。

(6)筛选细胞：融合12～24小时后就可以进行异核体分析，杂交前体细胞的死亡发生在前4～5天内，对于大多数融合前体细胞系而言，10～14天之内就可见杂交细胞克隆。

2．悬浮细胞融合

(1)将两种不同亲本的细胞各lml(约含107个细胞）混匀，以800r/min离心10分钟，沉淀杂交前体细胞，弃上清液，使之剩余体积约为1 ml，用手指弹拨离心管底或用手旋转离心管，使两种细胞混匀并重新悬浮。

(2）在混匀两种细胞的离心管中加入1 ml PEG-1000，置37℃水浴中作用2分钟，然后加入37℃预热的5 ml含有10％胎牛血清的MEM培养液，使PEG稀释并停止作用。于室温1000r/min离心5分钟，使细胞沉降，弃上清液。此时细胞已经融合。

(3）加5 ml无血清的MEM培养基，轻微旋转离心管以重悬细胞，并尽管不要打碎细胞，于室温1000r/min离心5分钟，并以此步骤再洗涤细胞1次。

(4）细胞洗涤2次后，在沉淀的细胞中加入含20％胎牛血清的HAT选择培养基，用吸管混匀，将细胞悬液用培养液稀释至5×l0⁴个／ml，接种于96孔培养板上，每孔0.l ml，置37℃,5% CO₂的孵箱中培养，24～48小时后选出融合细胞。

【结果】

用相差显微镜观察，在PEG处理2分钟内即可见许多正在融合的细胞。加入HAT选择培养基进行筛选细胞，即细胞融合12～24小时后就可进行异核分析。

【注意事项】

(1) PEG处理时间不能太长，否则会有多个细胞彼此融合成巨大的合胞体，合胞体不能存活。

(2）配液时要注意HAT的浓度，购买（Sigma)的100xHAT的HAT培养基终浓度：次黄嘌呤（H)15ug/ml，氨基蝶吟（A) 0.5ug/ml，胸苷（T)1Oug/ml。