胰岛散在于胰外分泌组织中呈岛状，是由数千个细胞组成的小器官。只有分离、收集胰岛才有可能解析其固有功能。胰岛从外分泌腺组织中分离称胰岛单离，尽管已建立了多种方法，但获得较高纯度的胰岛细胞仍较困难。胰岛细胞培养的应用极为广泛，如胰岛细胞代谢、细胞分泌激素及激素合成机制的解析，细胞表面抗原，细胞受体及细胞带电现象的研究，胰岛肿瘤化及对其有害药物的研究，以及胰岛移植的应用等。

【材料】

1．胰岛单离法

(1）组织来源：大鼠（250g左右）1～2只。

(2)试剂：Hanks液；胶原酶Ⅳ, I型或V型）；乙醚或戊巴比妥。

(3）器具：各种吸管，试管（吸管与试管最好硅化处理），35 mm塑料培养皿，玻璃蒸发皿（约50 mm左右）。解剖器具一套，20m1注射器，针头接4号静脉导管或21～23G翼状头皮针头，充满Hanks液。恒温振荡器（180～200r/min )。

2.胰岛收集法

(1)胶原酶消化后的胰组织。

(2) Ficoll-Conray液：如表4-2制备450ml A液，然后应按A→D→C→B顺序，分别制备B,C,D液。

A液：Fico11400终浓度8.3%,conray400（碘他拉酸钠Sodium iotalamate 66.8%溶液）终浓度11.1%，加葡萄糖lmg/ml，卡那霉素50ug/ml,酚磺酞0.002％等制成水溶液，高压灭菌后用NaHC0₃调整至pH 7.4,A液比重为1.095，渗透压396mOsm/L。

B液：在C液中加入等量的A液

C液：在D液中加入等量A液

D液：在A液中加等量灭菌蒸馏水

（3）Hanks液

(4）各种吸管、试管、离心管（最好硅化）

(5）涡旋混匀器

3.胰岛细胞分散法

(1）单离胰岛细胞100～500个。

(2）培养基：MEM,DMEM或RPMI 1640+5％～10％胎牛血清（FBS)。

(3）消化液：中性蛋白酶(dispase,1000U/ml),0.02％～0.04% EDTA/CMF液，无钙镁Hanks液（CMF-Hanks液）。

(4）器具：各种吸管，15 ml离心管，磁心棒（径15mm),10ml三角烧瓶（底面平坦便于磁心棒旋转，放入磁棒后高压灭菌），35 mm塑料培养皿或24孔，96孔微量培养板，细胞计数器一套，恒温磁力搅拌器。

【方法】

1．胰岛单离法

（1)摘取胰腺：

1)鼠在乙醚或戊巴比妥麻醉下固定四肢，开腹，找到肝、脾、胃和十二指肠等脏器的位置，切断肝叶间隙薄膜，反转至头侧，暴露胆总管的走行，在胆总管的末梢十二指肠开口处近肝侧留一把无钩钳，在有副胰管的情况下也留一把钳（图4-6)。

2）从肝管分支部向十二指肠侧周围组织中分离胆总管，绕一结扎线，于此部用剪刀剪开胆总管一小口，立即见黄色胆汁逆流溢出，从此口插入静脉导管的注射器，行向十二指肠并结扎固定（用翼状头皮针时可不剪开小口）。缓缓注入Hanks液约20m1，液体经胆总管逆流至胰管内，使其膨胀至胰尾，用镊子纯性剥离膨胀的胰腺并摘取下来，去除附着的脂肪组织与淋巴结等。

(2）消化胰腺：将膨胀的胰腺移至蒸发皿内，用眼科剪剪碎至lmm以下，倒入Hanks液，组织片沉下，去除漂浮的脂肪和膜等组织，移至试管内尽量吸掉Hanks液，留细切胰组织容量约为1 ml时，加入5 mg胶原酶粉，严密封盖后将试管置37℃恒温水浴振摇器上，沿着试管长轴水平振荡180～200次／分钟，约8～10分钟，取出试管振摇5～6秒，见组织片细薄均等，并附着于管壁，或在管壁上有约0.5 mm大小透明斑点附着，此状表示消化终了。

(3）收集消化细胞：于消化终了的胰腺组织试管中加入适量Hanks液，1200r/min离心1分钟，去上清液，如此再洗涤一次，如在沉渣中见有黏蛋白样物质，则用毛细吸管吸掉。

2．胰岛收集法（图4-7)

(1）于上法得到的沉渣中加A液（Ficoll-Conray) 3 ml,在涡旋混匀器上混合后，再用1 ml A液洗落附在管壁上的组织片，吹吸混匀，静置后沿管壁慢慢分层加入B,C,D液各2ml,3000r/min，离心10分钟，如完全单离时，胰岛将集中在C-D界面上。

(2）用毛细滴管从C-D界面取出胰岛集中于离心管中，加Hanks液吹吸混匀后，1200r/min离心1分钟，反复洗涤2次，最后用培养基悬浮培养。

3.胰岛细胞分散法

(1)单离的胰岛用毛细管移至离心管内，1200r/min离心2～3分钟，去上清。加入EDTA液5 ml，室温置5分钟，并间隔振摇，再次离心，去上清液；加入Dispase液1 ml混匀，静置，待胰岛沉淀，用毛细管吸上清液移至一个带磁心棒的三角烧瓶内，同样操作反复加Dispase液，总量用完4ml，注意在移加时不要丢失胰岛。将三角烧瓶放磁力搅拌器上，37℃，80～100r/min搅拌15分钟（图4-8）。

(2)用毛细管轻轻吹打数次使其分散，将三角烧瓶斜置，当未消化的胰岛下沉时，吸出上清液约3 ml收集于离心管中再补加2～3 ml培养基。在三角烧瓶中加Dispase液3 ml,进一步消化巧分钟，同样收集上清单个细胞，共消化3次可使单离胰岛完全分散。离心洗掉Dispase液以停止消化。集中的单个细胞最后用1200r/min离心5分钟后，用培养基再悬浮，计数存活率（通常为90％以上），将细胞调整至（5～10)x10⁴/ml接种于培养瓶皿中。