不同部位的气管上皮具有特征的构造与细胞组成。气管与大支气管较多覆盖多行纤毛上皮，由纤毛上皮细胞，无纤毛的上皮细胞与基底细胞等构成（图4-12)，细支气管被覆一层纤毛上皮细胞与无纤毛上皮细胞，覆盖细胞分为扁平的I型上皮细胞和立方状的Ⅱ型上皮细胞。气管上皮细胞培养对研究气管上皮细胞的增殖与分化、细胞功能及发癌机制等是极其有用的。

【材料】

1．家兔（2-3月龄，体重2～3kg)l～2只。

2．与C0₂气瓶连接的密闭容器或戊巴比妥，兔固定台，解剖用具、胶带、气管套管（用聚苯乙烯管加工，参照图，尼龙网（200目），弹簧夹等（结扎线，气管套管，尼龙网等均保存于75％乙醇中，用时用灭菌镊子取出）。

3．气管上皮细胞分离用溶液：F12、加5% FBS的F12,0.1％蛋白酶XI型、Ⅴ型（Sigma) ,使用前用F12溶解，滤过除菌。

4. 5xFl2-HEPES(F12粉末培养基106.38g，青霉素100万U，链霉素lg，与pH 7.3,1.5mo1/L的HEPES缓冲液100m1混合，待完全溶解后用双蒸水加至总量为2000m1,滤过除菌，分注200m1一瓶，至-20℃冻存）。

5．培养基5xF12-HEPES 100ml，双蒸水400m1,6% NaHCO₃10m1，牛胰岛素50mg，入转铁球蛋白5 mg，上皮生长因子（EGF)12.5 ug，牛垂体浸出液0.25 ml ;以上混合液滤过除菌，4℃保存可用1周。

6．纤连蛋白-白蛋白-晶体类胶原（fibronectin-albumin-vitrogen, FAV）铺底液入纤连蛋白（human fibronectin) 1 mg，牛血清清蛋白（BSA,1 mg/ml) 1 ml，庆大霉素10mg/ml，用双蒸水加到100m1。混合后滤过除菌，加入晶体类胶原（collagen corp ) 1 ml进行调整。FAV只要经灭菌后于4℃存放，可供随时使用。

7．器具各种吸管，15 ml或50m1离心管，20m1注射器，灭菌漏斗，60mm塑料培养皿，细胞计数器一套。

【方法】

1．气管摘除将家兔置密闭容器通入CO₂窒息而死或耳缘静脉注入戊巴比妥麻醉致死，用胶带将兔仰卧位固定于实验台上，常规碘酊、乙醇消毒皮肤。从腭下部沿正中线剪开胸、腹部，盖上胸部洞巾，开胸廓，用镊子分离颈部肌肉直达气管，剥离气管周围软组织及食管，注意不要伤及小血管。于最上部的气管和食管之间穿一结扎线，用剪刀在气管最上部前面横切（不要断离），将套管插入气管至结扎线处，于套管下端凸缘上方结扎固定，令结扎线卡在套管凸缘上方，结扎必须牢靠，提起套管拉直气管，继续向下剥离气管至分支处，将气管最下部切开（图4-13)。

2．气管上皮细胞的分离用F12液充分洗涤气管的内外，去除附着的血液等，浸入装有冰冷的F12液的50m1离心管中，用注射器吸取F12液气管内外再次洗涤，于气管近下端结扎，用注射器从套管注入足量的0.1％蛋白酶，使气管略膨胀，说明蛋白酶充满气管内腔，并注意蛋白酶不得外漏。将气管浸入装有50ml F12液的离心管中，加盖置4℃过夜。

3．次日用F12洗净气管外侧，用吸满了F12和5% FBS液的20ml注射器与套管相连，上下抽推数次以使蛋白酶液等从气管内出入，冲洗分离其上皮细胞，然后将气管下端结扎线剪断，使内液流出并通过200目尼龙网，将分离的细胞收集于50m1离心管内。1000r/min离心10分钟，去上清液，用F12和5% FBS液再悬浮。如此再重复洗涤1次，最后用培养液再悬浮细胞并计数，调整细胞浓度为5x10⁴～2x10⁵/ml。通常一个气管可获得了（3～7)x10⁶个细胞。用锥虫蓝染色检查存活率，要求在95％左右。

4．气管上皮细胞的培养于塑料培养皿内注入FAV1.5 ～2.0ml铺底，室温下静置2～3小时，将余下的FAV吸掉（可保存再用）。每个平皿可接种气管上皮细胞（5x10⁴～2x10⁵)/5 ml，置于37℃,5% CO₂孵箱内培养。培养开始后数小时细胞可附着，12～24小时可完全附着（接种率约为10%）;24～48小时后开始增殖，细胞在平皿底面全面铺开，即呈融合状，多层化，但无明显克隆形成。