胆管和胆囊上皮细胞的分离和纯化比较容易，一般只需胶原酶消化，再经密度梯度离心或免疫磁珠等方法分离，即可获得大量高纯度的上皮细胞。但是胆管上皮细胞在体外的生长维持时间较短，易失去增殖能力。

【材料】

1．组织来源家兔（2～3月龄）；鼠3T3成纤维细胞（用做滋养层细胞）。

2.培养液及添加剂DMEM/F12培养液、胎牛血清等；内皮细胞生长因子、三碘甲状腺素、转铁蛋白、霍乱毒素、腺嘌呤,L-脯氨酸、肝细胞生长因子（HGF)，鼠尾胶原（或胶原蛋白）；青霉素200U/ml、链霉素200ug/ml。

3．消化液0.125% Ⅳ型胶原酶溶液。

4．器具手术刀、眼科剪、镊，25 ml培养瓶、24孔培养板。

【方法】

1．在制备兔胆管和胆囊上皮细胞之前，先准备好细胞的培养容器，可用滋养层细胞和用胶原蛋白包被培养皿等两种方法，即取生长良好的鼠3T3成纤维细胞，经射线照射后作为滋养层细胞，这样做可使胆管上皮细胞的存活时间由原先的1周左右增至4周，且可使细胞数量大增；另外，也可用鼠尾胶原或胶原蛋白包被25 ml培养瓶或24孔培养板等，以备培养使用。

2．用戊巴比妥钠麻醉家兔后，消毒皮肤，剖腹，从肝脏下分离胆囊，排净胆汁后，将胆囊切开用添加了青、链霉素的DMEM培养液清洗胆囊黏膜表面。

3．在无菌条件下用眼科镊夹住胆囊，再用眼科剪将胆囊剪成2～3mm大小组织块，并将胆囊黏膜面朝下放置在平皿内加入0.125%W型胶原酶溶液，置37℃下消化胆囊组织10～15分钟，然后加入适量含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。

4．将收集的细胞悬液离心（1000r/min离心5～8分钟），弃上清液，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养液调整细胞浓度为（4～5)x10⁴个／ml。

5．将细胞接种在备好的带有滋养层细胞的培养皿内，或接种在经鼠尾胶原或胶原蛋白包被的25 ml培养瓶或24孔培养板上，置37℃,5% CO₂孵箱内培养4～7天，待细胞贴壁后，每3天更换1次培养液。

【培养结果及鉴定】

1．培养早期（1～2天）细胞呈悬浮生长，以后（3～6天）细胞逐渐贴壁，10天左右可形成单层细胞。细胞呈圆形，且相互连接，但当培养至10～14天后，细胞开始会出现脱壁死亡现象。

2．如果使用滋养层细胞做基质培养胆囊上皮细胞的效果会更好，而且在胆囊上皮细胞刚接种至培养皿或24孔培养板时，在培养液中加入一些促细胞生长的添加剂，如内皮细胞生长因子、三碘甲状腺素、转铁蛋白、霍乱毒素、腺p,T吟,L一脯氨酸等，若加入肝细胞生长因子(HGF)，则对胆管上皮细胞具有更强的促增殖作用，可使细胞增殖维持3～5个月，细胞数量可增加100万倍，且可连续培养7～9代。

3．可用胆囊上皮细胞标志物（如细胞角蛋白7,19，糖蛋白34,γ-谷酞氨转肽酶等）的免疫荧光染色来鉴定胆囊上皮细胞。